Kvasi-metagenomic analyse af Salmonella fra mad og miljøprøver
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at forberede samordnet registrerings- og subtyping af Salmonella gennem quasimetagenomic sekventering DNA-prøver fra mad og miljø microbiomes. Den kombinerede brug af kultur berigelse, immunomagnetic adskillelse (IMS) og flere forskydning forstærkning (MDA) giver mulighed for effektiv koncentration af Salmonella genomisk DNA fra mad og miljøprøver.
Abstract
Quasi-metagenomics sekventering refererer til sekvensering-baseret analyse af modificerede microbiomes af levnedsmidler og miljøprøver. I denne protokol, er microbiome ændring designet til at koncentrere genomisk DNA af target fødevarebårne patogen forurenende stof at lette påvisning og subtyping af patogenet i en enkelt arbejdsgang. Her, vi forklare og demonstrere prøve forberedelsestrin for kvasi-metagenomics analyse af Salmonella enterica fra repræsentative levnedsmidler og miljøprøver herunder lucernespirer, jorden sort peber, hakket oksekød, kylling bryst og miljømæssige svaberprøver. Prøver underkastes først kultur berigelse af Salmonella for en forkortet og justerbar varighed (4-24 h). Salmonella celler er derefter selektivt fanget fra berigelse kultur af immunomagnetic adskillelse (IMS). Endelig er flere forskydning forstærkning (MDA) udført for at forstærke DNA fra IMS-fanget celler. DNA output af denne protokol kan blive sekventeret af høj overførselshastighed sekventering platforme. En valgfri kvantitativ PCR analyse kan udføres for at erstatte sekventering for Salmonella påvisning eller vurdere koncentrationen af Salmonella DNA før sekvensering.
Introduction
Metagenomics sekventering teoretisk tillader samordnet registrerings- og subtyping af fødevarebårne patogener. Dog nuværende fødevareprøver udfordringer til patogen analyse af direkte sekventering af mad microbiome. Først, fødevarebårne patogener er ofte til stede på et lavt niveau i fødevareprøver. De fleste af de kommercielt tilgængelige hurtig påvisningsmetoder stadig kræver 8-48 h dyrkning for at berige patogen celler til en påviselig niveau1. For det andet, mange fødevarer indeholder rigelige mikroflora celler og/eller mad DNA, gør fødevarebårne patogen DNA en lille brøkdel af mad metagenome og et undvigende mål for registrerings- og subtyping ved direkte metagenomic sekvensering.
Ændring af fødevarer microbiomes er blevet rapporteret at tillade betydelig koncentration af fødevarebårne patogen DNA til at lette sekvenseringen-baseret detektion af Shiga toksin-producerende Escherichia coli2,3 og Salmonella enterica4. Fordi modificerede fødevarer microbiomes er stadig blandinger af forskellige mikrobielle arter, deres sekventering, der betegnes som quasi-metagenomic analyse4. Microbiome ændring kan udføres af kultur berigelse alene2,3 eller i kombination med immunomagnetic adskillelse (IMS) og flere forskydning forstærkning (MDA)4,5. IMS kan selektivt fange patogen celler fra berigelse kultur via antistof-magnetiske perler. MDA kan generere tilstrækkelige mængder af genomisk DNA til sekvensering gennem højeffektive ɸ29 DNA polymerase6. IMS-MDA har tilladt kultur-uafhængig patogen detektion fra kliniske prøver7, og afkortning af kultur berigelse for registrering af kvasi-metagenomic og subtyping af Salmonella i levnedsmidler prøver4.
Det overordnede mål med denne metode er at forberede kvasi-metagenomic DNA fra fødevareprøver tillade målrettede koncentration af Salmonella genomisk DNA og efterfølgende registrering og subtyping af Salmonella forurenende af sekventering. I forhold til standard metoder for Salmonella påvisning8,9 og subtyping10, kan quasimetagenomic tilgang betydeligt forkorte ekspeditionstid fra kontaminerede levnedsmidler og miljøprøver til molekylære undertyper af patogenet af forene to typisk opdelt analyser i en enkelt arbejdsgang. Denne metode er særlig nyttig til applikationer såsom fødevarebårne udbrud svar og andre spor tilbage undersøgelser hvor robust patogen subtyping kræves ud over patogen detektion og hurtig analytiske turnaround er vigtigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund af den ofte-lav overflod og i homogen forekomst af Salmonella i levnedsmidler og miljøprøver, kultur berigelse før IMS-MDA er stadig nødvendige for Salmonella registrerings- og subtyping; Det er derfor et afgørende skridt i protokollen. For at identificere optimale betingelser for at øge overfloden af Salmonella i forhold til prøven baggrund flora, kan forskellige berigelse medier vurderes for specifikke prøver. MLG og BAM, kan både selektivt medie såsom RV bouillon og ikke-…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Mark Harrison og Gwen Hirsch af University of Georgia venligst give den bakterielle stamme og anden støtte til denne undersøgelse.
Materials
| Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
| Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
| Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
| Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
| Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
| 50ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
| Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
| StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4C |
| Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80C |
| MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80C |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
| Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80C |
| HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
| DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4C |
| Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |
Referências
- Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., Cutter, C. N. Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing. PLoS One. 11 (12), e0167870 (2016).
- Hyeon, J. Y., et al. Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
- Hyeon, J. Y., Deng, X. Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification. Food Microbiology. 63, 111-116 (2017).
- Hosono, S., et al. Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples. Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).
- Seth-Smith, H. M., et al. Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture. Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).
- Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., Hammack, T. S. Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method. Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).
- Jacobson, A. P., Hammack, T. S., Andrews, W. H. Evaluation of sample preparation methods for the isolation of Salmonella from alfalfa and mung bean seeds with the Bacteriological Analytical Manual’s Salmonella culture method. Journal of AOAC International. 91 (5), 1083-1089 (2008).
- Deng, X., et al. Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).
- . Microbiology Laboratory Guidebook Available from: https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook (2018)
- . Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella Available from: https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm (2018)
- Malorny, B., et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).
- June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study. Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).
- Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load. Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).
- Wood, D. E., Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), R46 (2014).
- Davis, S., Pettengill, J. B., Luo, Y., Payne, J., Shpuntoff, A., Rand, H., Strain, E. CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data. PeerJ Computer Science. 1 (e20), (2015).
- Zhang, S., et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).
- Rodrigue, S., et al. Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells. PLoS One. 4 (9), e6864 (2009).
- Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., Shinoda, S. Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria. Front Public Health. 2, 103 (2014).
