Quasi-metagenomic analyses van Salmonella uit voedsel en milieu voorbeelden
Summary
Hier presenteren we een protocol ter voorbereiding van de DNA-monsters van het voedsel en milieu microbiomes voor gezamenlijke detectie en subtypering van Salmonella via quasimetagenomic sequencing. Het gecombineerd gebruik van cultuur verrijking, immunomagnetic scheiding (IMS) en meerdere verplaatsing mogelijk versterking (MDA) van de effectieve concentratie van Salmonella genomic DNA van voedsel en milieu monsters.
Abstract
Quasi-metagenomics sequencing verwijst naar de volgorde gebaseerde analyse van gewijzigde microbiomes van voedsel en milieu monsters. In dit protocol is microbiome wijziging ontworpen om genomic DNA van een target foodborne pathogen verontreinigingen te vergemakkelijken van de opsporing en subtypering van het pathogene agens in een afzonderlijke workflow concentreren. Hier, we uitleggen en demonstreren de sample voorbereiding stappen voor de analyse van de quasi-metagenomics van Salmonella enterica uit representatieve voedsel en milieu monsters, met inbegrip van alfalfa spruiten, gemalen zwarte peper, gemalen rundvlees, kip borst en milieu-swabs. Monsters worden eerst onderworpen aan de verrijking van de cultuur van Salmonella gedurende een verkorte en verstelbaar (4-24 h). Salmonella cellen worden vervolgens selectief opgevangen uit de cultuur van verrijking door immunomagnetic scheiding (IMS). Ten slotte, meerdere verplaatsing versterking (MDA) wordt uitgevoerd om te vergroten van DNA uit cellen IMS-gevangen. De output van de DNA van dit protocol kan worden sequenced door hoge doorvoer sequencing platformen. Een optionele kwantitatieve PCR analyse kan worden uitgevoerd ter vervanging van de volgorde van Salmonella detectie of beoordelen van de concentratie van Salmonella DNA alvorens sequencing.
Introduction
Metagenomics sequencing kan theoretisch gezamenlijke detectie en subtypering van door voedsel overgedragen ziekteverwekkers. Echter presenteren voedsel monsters uitdagingen voor de pathogeen-analyse door het directe rangschikken van de voedsel-microbiome. Ten eerste, foodborne ziekteverwekkers zijn vaak aanwezig op een laag niveau in monsters van levensmiddelen. De meeste van de commercieel beschikbare snelle detectie-methoden nog vereisen 8-48 h kweken om te verrijken pathogen cellen tot een aantoonbaar niveau1. Ten tweede, veel voedingsmiddelen bevatten overvloedige microflora cellen en/of voedsel DNA, waardoor foodborne pathogen DNA een klein deel van de voedsel-metagenome en een ongrijpbare doel voor detectie en subtypering door metagenomic sequencing directe.
Wijziging van voedsel microbiomes is gemeld dat een aanzienlijke concentratie van foodborne pathogen DNA te vergemakkelijken sequencing gebaseerde detectie van Shiga-toxine-producerende Escherichia coli2,3 pt Salmonella enterica4. Omdat gemodificeerde levensmiddelen microbiomes zijn nog steeds mengsels van verschillende soorten van microbiële, hun volgorde wordt genoemd als quasi-metagenomic analyses4. Wijziging van de Microbiome kan worden uitgevoerd door cultuur verrijking alleen2,3 , of in combinatie met immunomagnetic scheiding (IMS) en meerdere verplaatsing versterking (MDA)-4,5. IMS kunt selectief pathogen cellen uit de cultuur van de verrijking via magnetische kralen antilichaam beklede vastleggen. MDA kan het genereren van voldoende hoeveelheden genomic DNA voor het rangschikken tot en met de zeer efficiënte ɸ29 polymerase van DNA6. IMS-MDA heeft cultuur-onafhankelijke pathogen detectie van klinische monsters7, verkorting van de verrijking van de cultuur voor quasi-metagenomic detectie en subtypering van Salmonella in levensmiddelen monsters4toegestaan.
Het algemene doel van deze methode is om voor te bereiden van quasi-metagenomic DNA van voedsel monsters dat gerichte concentratie van Salmonella genomic DNA en latere detectie en subtypering van de Salmonella -verontreiniging door sequentiebepaling. Vergeleken met standaardmethoden voor Salmonella detectie8,9 pt10subtypering, kan de aanpak van de quasimetagenomic de doorlooptijd van besmet voedsel en milieu monsters aanzienlijk verkorten moleculaire subtypen van het pathogene agens door het verenigen van de twee meestal gescheiden analyses in een enkele workflow. Deze methode is vooral handig voor toepassingen zoals door voedsel overgedragen uitbraak reactie en andere trace terug onderzoeken waar robuuste pathogen subtypering is vereist naast pathogen detectie en snelle analytische ommekeer is belangrijk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanwege de vaak lage overvloed en in-homogene aanwezigheid van Salmonella in levensmiddelen en milieu monsters, cultuur verrijking voor IMS-MDA is nog steeds noodzakelijk voor Salmonella detectie en subtypering; het is daarom een belangrijke stap van het protocol. Om optimale omstandigheden te verhogen van de overvloed van Salmonella ten opzichte van monster achtergrond flora, kan verschillende verrijking media voor specifieke monsters worden geëvalueerd. Volgens MLG en BAM, kunnen zowel selec…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank Mark Harrison en Gwen Hirsch van de Universiteit van Georgia voor het vriendelijk verstrekken de bacteriële stam en andere steun aan deze studie.
Materials
| Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
| Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
| Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
| Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
| Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
| 50ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
| Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
| StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4C |
| Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80C |
| MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80C |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
| Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80C |
| HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
| DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4C |
| Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |
Referências
- Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., & Cutter, C. N. Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., & Elkins, C. A. Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., & Elkins, C. A. Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing. PLoS One. 11 (12), e0167870 (2016).
- Hyeon, J. Y. et al. Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples. Applied and Environmental Microbiology. (2017).
- Hyeon, J. Y., & Deng, X. Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification. Food Microbiology. 63 111-116 (2017).
- Hosono, S. et al. Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples. Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).
- Seth-Smith, H. M. et al. Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture. Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).
- Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., & Hammack, T. S. Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method. Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).
- Jacobson, A. P., Hammack, T. S., & Andrews, W. H. Evaluation of sample preparation methods for the isolation of Salmonella from alfalfa and mung bean seeds with the Bacteriological Analytical Manual's Salmonella culture method. Journal of AOAC International. 91 (5), 1083-1089 (2008).
- Deng, X. et al. Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).
- Anonymous. Microbiology Laboratory Guidebook. <www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook> (2018).
- Andrews, W. H., Wang, H., Jacobson, A., & Hammack, T. Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella., <www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm> (2018).
- Malorny, B. et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).
- June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., & Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study. Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).
- Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., & Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load. Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).
- Wood, D. E., & Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), R46 (2014).
- Davis S, P. J., Luo Y, Payne J, Shpuntoff A, Rand H, Strain E. CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data. PeerJ Computer Science. 1 (e20) (2015).
- Zhang, S. et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).
- Rodrigue, S. et al. Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells. PLoS One. 4 (9), e6864 (2009).
- Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., & Shinoda, S. Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria. Front Public Health. 2, 103 (2014).
