Quasi-métagénomique analyse des Salmonella dans les aliments et les échantillons environnementaux
Summary
Nous présentons ici un protocole pour préparer des échantillons d’ADN provenant des aliments et environnement microbiomes détection concertée et sous-typage des Salmonella par séquençage de quasimetagenomic. L’utilisation combinée de l’enrichissement de la culture, séparation immunomagnétique (IMS) et le déplacement de plusieurs amplification (MDA) permet une concentration efficace de l’ADN génomique de Salmonella provenant des aliments et les échantillons environnementaux.
Abstract
Quasi-métagénomique séquençage se réfère à l’analyse basée sur le séquençage de mis à jour le microbiomes des aliments et les échantillons environnementaux. Dans ce protocole, microbiome modification vise à concentrer l’ADN génomique d’un contaminant de pathogènes d’origine alimentaire cible afin de faciliter la détection et le typage de l’agent pathogène dans un seul flux de travail. Ici, nous expliquer et démontrer les étapes de préparation d’échantillon pour l’analyse de quasi-métagénomique de Salmonella enterica de nourriture représentatif et les échantillons environnementaux, y compris les germes de luzerne, de poivre noir moulu, boeuf haché, poitrine de poulet et les échantillons environnementaux. Les échantillons sont d’abord soumis à l’enrichissement de la culture de Salmonella pour une durée raccourcie et réglable (4 à 24 h). Cellules de Salmonella sont ensuite sélectivement capturés dans la culture d’enrichissement par séparation immunomagnétique (IMS). Enfin, plusieurs amplification de déplacement (MDA) est effectuée afin d’amplifier l’ADN de cellules IMS-capturé. La sortie de l’ADN du présent protocole peut être séquencée par des plateformes de séquençage à haut débit. Une analyse PCR quantitative en option peut être effectuée pour remplacer le séquençage pour la détection de Salmonella ou évaluer la concentration de Salmonella ADN avant de séquençage.
Introduction
Séquençage métagénomique permet théoriquement concertée de détection et de sous-typage des pathogènes d’origine alimentaire. Cependant, des échantillons d’aliments présentent des défis pour l’analyse de l’agent pathogène par séquençage direct du microbiome alimentaire. Tout d’abord, pathogènes d’origine alimentaire sont souvent présents à de faibles concentrations dans les échantillons d’aliments. La plupart des méthodes de détection rapide disponible dans le commerce encore exigent 8 à 48 h de culture afin d’enrichir les cellules pathogènes à un niveau détectable1. Deuxièmement, beaucoup d’aliments contiennent des cellules de microflore abondante et/ou aliments ADN, faisant ADN du pathogène d’origine alimentaire une petite fraction des aliments métagénome et une cible insaisissable pour la détection et le typage métagénomique séquençage directement.
Modification des aliments microbiomes a signalé afin de permettre une concentration importante de pathogènes d’origine alimentaire ADN afin de faciliter la détection basée sur le séquençage des Escherichia coliproductrices de toxine Shiga2,3 et Salmonella enterica4. Parce que les aliments modifiés microbiomes sont toujours des mélanges de différentes espèces microbiennes, leur séquençage est nommé comme quasi-métagénomique analyse4. Microbiome modification peut être effectuée par la culture enrichissement seuls2,3 , ou en combinaison avec séparation immunomagnétique (IMS) et de multiples déplacements amplification (MDA)4,5. IMS peut capturer sélectivement les cellules pathogènes de la culture d’enrichissement par l’intermédiaire de billes magnétiques revêtus d’anticorps. MDA peut produire une quantité suffisante d’ADN génomique pour l’ordonnancement par le biais de l’ ADN polymérase de ɸ29 très efficace6. IMS-MDA a permis la détection des pathogènes indépendants de la culture des échantillons cliniques7et le raccourcissement de l’enrichissement de la culture pour la détection de quasi-métagénomique et sous-typage des salmonelles dans les échantillons de nourriture4.
L’objectif général de cette méthode est de préparer la quasi-métagénomiques ADN provenant d’échantillons de nourriture pour permettre la concentration ciblée de l’ADN génomique de Salmonella et de détection ultérieure et de sous-typage du contaminant Salmonella par séquençage. Par rapport aux méthodes standards pour la détection de Salmonella 8,9 et sous-typage de10, l’approche de quasimetagenomic peut raccourcir considérablement le temps d’immobilisation des aliments contaminés et les échantillons environnementaux sous-types moléculaires de l’agent pathogène en unifiant les deux généralement séparés des analyses dans un seul flux de travail. Cette méthode est particulièrement utile pour des applications telles que la riposte aux flambées épidémiques d’origine alimentaire et d’autres investigations arrière de trace où le sous-typage pathogène robuste est nécessaire en plus de la détection des pathogènes et rapide revirement analytique est important.
Protocol
Representative Results
Discussion
En raison du souvent faible abondance et homogène en présence de Salmonella dans les aliments et les échantillons environnementaux, enrichissement de la culture avant IMS-MDA est encore nécessaire pour la détection de Salmonella et de sous-typage ; C’est donc une étape cruciale du protocole. Pour identifier les conditions optimales d’augmenter l’abondance des salmonelles par rapport à la flore fond échantillon, milieux d’enrichissement différents peut-être être évaluées po…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier Mark Harrison et Gwen Hirsch de l’Université de Georgie pour aimablement la souche bactérienne et autres formes de soutien à cette étude.
Materials
| Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
| Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
| Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
| Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
| Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
| 50ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
| Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
| StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4C |
| Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80C |
| MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80C |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
| Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80C |
| HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
| DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4C |
| Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |
Referências
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