食品および環境試料からのサルモネラの準メタゲノム解析
Summary
ここでは、協調検出およびサルモネラの quasimetagenomic シーケンスを通じてサブタイピングの食糧および環境内細菌叢解析からの DNA のサンプルを準備するためのプロトコルを提案する.併用文化濃縮、原因菌分離 (IMS)、複数の変位の増幅 (MDA) により、サルモネラ食糧および環境試料からゲノム DNA の効果的な濃度。
Abstract
準メタゲノム配列決定は、食品、環境サンプルの修正内細菌叢解析のシーケンス解析を指します。このプロトコルではマイクロバイ変更対象食品由来の病原体の汚染物質の検出を容易にするためにゲノム DNA の単一のワークフローに病原体のサブタイプの集中です。ここでは、私たちを説明する代表的な食品とアルファルファもやしを含む環境試料からのサルモネラ準メタゲノム解析の準備手順、サンプル挽き黒こしょう、牛ひき肉、鶏の胸肉を示すと環境の綿棒。サンプルは最初文化豊かなサルモネラの短縮、調節可能な期間 (4-24 h) を受けます。サルモネラ細胞は、原因菌分離 (IMS) によって濃縮文化から選択的にキャプチャされます。最後に、IMS にキャプチャされたセルからの DNA を増幅するため複数の変位増幅 (MDA) が実行されます。高スループット シーケンスのプラットフォームでは、このプロトコルの DNA 出力を配置できます。サルモネラ検出シーケンスを置換またはシーケンスの前にサルモネラDNA の濃度を評価するオプションの定量的 PCR 解析を実行できます。
Introduction
メタゲノム配列には、協調の検出および食品由来病原体のサブタイピング理論的にことができます。しかし、食品サンプルは食品マイクロバイの直接配列による病原体解析への挑戦を提示します。まず、食中毒の病原体が多い現在低レベルで食品サンプルで。市販の急速な検出方法をまだ必要と 8-48 h 培養検出レベル1に病原体細胞を豊かにします。第二に、多くの食品に含まれる豊富な微生物細胞または食品 DNA、メタゲノム配列直接によって検出およびサブタイピングのため食品メタゲノムととらえどころのないターゲットのごく一部食品由来病原体の DNA を作るします。
食品由来病原体の志賀毒素産生性大腸菌2,3とシーケンス ベースの検出を容易にする DNA の相当な集中を許可する食品内細菌叢解析の修正が報告されています。サルモネラ4。組換え食品のため内細菌叢解析はまだ別の微生物種の混合物、そのシーケンスは準メタゲノム解析4と呼ばれます。文化濃縮だけで2,3原因菌分離 (IMS) と組み合わせて、複数変位増幅 (MDA)4、5マイクロバイ変更を実行できます。IMS は、抗体をコートした磁気ビーズを介して培養から病原体細胞を選択的にキャプチャできます。MDA は、非常に効率的な ɸ29 DNA ポリメラーゼ6配列のゲノム DNA の十分な量を生成できます。IMS MDA は臨床サンプル7、文化豊かな準メタゲノム検出のための短縮と食品サンプル4でサルモネラのサブタイプからカルチャに依存しない病原体検出を許可しています。
このメソッドの全体的な目標は、サルモネラDNA とそれ以降の検出の対象となる濃度とシーケンスによるサルモネラ汚染のサブタイプを許可する食品サンプルから準 metagenomic DNA を準備することです。Quasimetagenomic アプローチが汚染された食物や環境のサンプルからの所要時間を大幅に短縮できますサルモネラ検出8,9の標準的な方法と比較制約条件およびサブタイピング10、通常 2 つの統一によって病原体の分子サブタイプは、単一のワークフローに解析を分離しました。このメソッドは、堅牢な病原体サブタイプが病原体検出に加えて必要と迅速分析が重要な他のトレース バック調査食品由来アウトブレイクの応答などのアプリケーションに特に役立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
しばしば低豊富,サルモネラの食品および環境試料中の存在で均一な文化濃縮 IMS MDA の前に必要がありますサルモネラ検出条件およびサブタイピング;したがって、プロトコルの重要なステップです。サンプル背景植物に対するサルモネラの豊かさを高めるための最適な条件を識別するために、特定のサンプルの異なる濃縮メディアが評価されます。MLG と BAM によると RV ス?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、マーク ・ ハリソンと細菌の系統と本研究にその他のサポートを提供する親切ジョージア大学のグウェン ハーシュに感謝したいと思います。
Materials
| Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
| Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
| Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
| Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
| Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
| 50ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
| Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
| StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4C |
| Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80C |
| MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80C |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
| Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80C |
| HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
| DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4C |
| Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |
Referências
- Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., & Cutter, C. N. Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., & Elkins, C. A. Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., & Elkins, C. A. Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing. PLoS One. 11 (12), e0167870 (2016).
- Hyeon, J. Y. et al. Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples. Applied and Environmental Microbiology. (2017).
- Hyeon, J. Y., & Deng, X. Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification. Food Microbiology. 63 111-116 (2017).
- Hosono, S. et al. Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples. Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).
- Seth-Smith, H. M. et al. Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture. Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).
- Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., & Hammack, T. S. Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method. Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).
- Jacobson, A. P., Hammack, T. S., & Andrews, W. H. Evaluation of sample preparation methods for the isolation of Salmonella from alfalfa and mung bean seeds with the Bacteriological Analytical Manual's Salmonella culture method. Journal of AOAC International. 91 (5), 1083-1089 (2008).
- Deng, X. et al. Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).
- Anonymous. Microbiology Laboratory Guidebook. <www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook> (2018).
- Andrews, W. H., Wang, H., Jacobson, A., & Hammack, T. Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella., <www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm> (2018).
- Malorny, B. et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).
- June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., & Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study. Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).
- Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., & Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load. Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).
- Wood, D. E., & Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), R46 (2014).
- Davis S, P. J., Luo Y, Payne J, Shpuntoff A, Rand H, Strain E. CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data. PeerJ Computer Science. 1 (e20) (2015).
- Zhang, S. et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).
- Rodrigue, S. et al. Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells. PLoS One. 4 (9), e6864 (2009).
- Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., & Shinoda, S. Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria. Front Public Health. 2, 103 (2014).
