음식과 환경 샘플에서 살 모 넬 라 의 준 metagenomic 분석
Summary
여기, 선물이 공동된 검색 및 quasimetagenomic 시퀀싱을 통해 살 모 넬 라의 동등에 대 한 음식과 환경 microbiomes에서 DNA 샘플을 준비 하는 프로토콜. 사용 문화 농축, immunomagnetic 분리 (IMS), 및 다중 변위 증폭 (MDA) 음식과 환경 샘플에서 살 모 넬 라 genomic DNA의 효과적인 농도 하실 수 있습니다.
Abstract
준 metagenomics 시퀀싱 음식과 환경 샘플의 수정 된 microbiomes의 시퀀싱 기반 분석을 말합니다. 이 프로토콜에서 미생물 수정 대상 foodborne 병원 체 오염 물질의 탐지를 촉진 하기 위하여 genomic DNA와 단일 워크플로에 병원 체의 동등을 집중 하도록 설계 되었습니다. 여기, 우리가 설명 대표 음식과 알 팔 파 콩나물을 포함 하 여 환경 샘플에서 살 모 넬 라 enterica 준 metagenomics 분석에 대 한 샘플 준비 단계 지상 검은 후추, 갈은 쇠고기, 닭고기 가슴 보여주는 그리고 환경 면봉입니다. 샘플 먼저 동안 단축 및 조절 (4-24 h) 살 모 넬 라 의 문화 강화를 받게 됩니다. 살 모 넬 라 셀 다음 선택적으로 캡처됩니다 농축 문화에서 immunomagnetic 분리 (IMS)에 의해. 마지막으로, 다중 변위 증폭 (MDA)는 IMS 캡처한 세포에서 DNA를 증폭 하는 수행 됩니다. 이 프로토콜의 DNA 출력 높은 처리량 시퀀싱 플랫폼으로 시퀀싱 될 수 있습니다. 살 모 넬 라 검출에 대 한 시퀀싱을 대체 하거나 시퀀싱 전에 살 모 넬 라 DNA의 농도 평가 하는 선택적 정량 PCR 분석을 수행할 수 있습니다.
Introduction
Metagenomics 시퀀싱은 이론적으로 공동된 탐지 및 foodborne 병원 체의 동등 수 있습니다. 그러나, 음식 샘플 식품 미생물의 직접적인 연속 병원 체 분석 과제를 제시합니다. 첫째, foodborne 병원 체 들은 현재 수준 낮은 음식 샘플에 있습니다. 여전히 상용 신속한 검출 방법의 대부분 8-48 h 감지 레벨1로 병원 체 세포를 풍부 하 게 재배 해야 합니다. 둘째, 풍부한 microflora 셀 및 음식 만들기 foodborne 병원 체 DNA 음식 metagenome 및 애매 한 대상의 극히 metagenomic 시퀀싱 직접 검색 및 동등에 대 한 DNA 포함 하는 많은 음식.
음식 microbiomes의 foodborne 병원 체 시가 독 소 생산 대장균2,3 , 의 시퀀싱 기반 탐지를 촉진 하기 위하여 DNA의 내용이 풍부한 농도 수 있도록 보고 되었습니다. 살 모 넬 라 enterica4. 변형 식품 때문에 microbiomes는 여전히 다른 미생물 종의 혼합물, 그들의 시퀀싱은 준 metagenomic 분석4으로 불린다. 미생물 수정 문화 농축 혼자2,3 또는 다중 변위 증폭 (MDA)4,5immunomagnetic 분리 (IMS)와 함께에서 수행할 수 있습니다. IMS는 선택적으로 항 체-코팅 된 자석 구슬을 통해 농축 문화에서 병원 체 세포를 캡처할 수 있습니다. MDA는 고효율 ɸ29 DNA 중 합 효소6시퀀싱에 대 한 게놈 DNA의 충분 한 양을 생성할 수 있습니다. IMS-MDA는 임상 샘플7, 준 metagenomic 검색 문화 농축의 단축 및 식품 샘플4 살 모 넬 라 의 동등에서 문화권 병원 체 탐지를 허용 했다.
이 방법의 전반적인 목표 음식 샘플에서 살 모 넬 라 genomic DNA와 후속 검색의 타겟된 농도 및 시퀀싱에 의해 살 모 넬 라 오염 물질의 동등 하 준 metagenomic DNA를 준비 하는 것입니다. 살 모 넬 라 검출8,9 에 대 한 표준 방법에 비해와10동등, quasimetagenomic 접근 실질적으로 오염 된 음식과 환경 샘플에서 처리 시간을 단축 수 있습니다. 일반적으로 두 가지를 통합 하 여 병원 체의 분자 하위 단일 워크플로우로 분석을 분리. 이 메서드는 식중독 발발 응답 및 다른 추적 다시 조사 병원 체 검출 이외에 필요한은 강력한 병원 체 동등 그리고 신속한 분석 처리 중요 한 특히 유용 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
종종 로우 풍부 음식과 환경 샘플에서 살 모 넬 라 의 동질적인 존재 때문에, IMS MDA 전에 문화 농축은 여전히 살 모 넬 라 검출 및 동등; 따라서 프로토콜의 중요 한 단계 이다. 샘플 배경 식물을 기준으로 살 모 넬 라 를 풍부 하 게 증가 하는 최적의 조건을 식별 하기 위해 다른 농축 미디어 특정 샘플에 대 한 평가 될 수 있습니다. MLG와 BAM, 음식 샘플에서 살 모 넬 라 농축…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 마크 해리슨과 세균성 긴장 및 다른 지원이이 연구에 친절 하 게 제공에 대 한 조지아 대학의 그웬 허쉬 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
| Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
| Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
| Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
| Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
| 50ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
| Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
| StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4C |
| Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80C |
| MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80C |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
| Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80C |
| HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
| DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4C |
| Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |
Referências
- Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., & Cutter, C. N. Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., & Elkins, C. A. Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., & Elkins, C. A. Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing. PLoS One. 11 (12), e0167870 (2016).
- Hyeon, J. Y. et al. Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples. Applied and Environmental Microbiology. (2017).
- Hyeon, J. Y., & Deng, X. Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification. Food Microbiology. 63 111-116 (2017).
- Hosono, S. et al. Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples. Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).
- Seth-Smith, H. M. et al. Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture. Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).
- Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., & Hammack, T. S. Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method. Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).
- Jacobson, A. P., Hammack, T. S., & Andrews, W. H. Evaluation of sample preparation methods for the isolation of Salmonella from alfalfa and mung bean seeds with the Bacteriological Analytical Manual's Salmonella culture method. Journal of AOAC International. 91 (5), 1083-1089 (2008).
- Deng, X. et al. Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).
- Anonymous. Microbiology Laboratory Guidebook. <www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook> (2018).
- Andrews, W. H., Wang, H., Jacobson, A., & Hammack, T. Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella., <www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm> (2018).
- Malorny, B. et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).
- June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., & Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study. Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).
- Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., & Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load. Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).
- Wood, D. E., & Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), R46 (2014).
- Davis S, P. J., Luo Y, Payne J, Shpuntoff A, Rand H, Strain E. CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data. PeerJ Computer Science. 1 (e20) (2015).
- Zhang, S. et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).
- Rodrigue, S. et al. Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells. PLoS One. 4 (9), e6864 (2009).
- Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., & Shinoda, S. Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria. Front Public Health. 2, 103 (2014).
