Her presenterer vi en protokoll for å forberede DNA-prøver fra mat og miljø microbiomes felles gjenkjennings- og subtyping av Salmonella gjennom quasimetagenomic sekvenser. Kombinert bruk av kultur berikelse, immunomagnetic separasjon (IMS) og flere forskyvning forsterkning (MDA) gir effektiv konsentrasjon av Salmonella genomisk DNA fra mat og miljøprøver.
Quasi-metagenomics sekvensering refererer til sekvensering-basert analyse av modifisert microbiomes mat og miljøprøver. I denne protokollen, er microbiome modifisering designet for å konsentrere genomisk DNA av en målet matbårne patogen miljøgifter å lette oppdagelsen og subtyping av patogen i en enkelt arbeidsflyt. Her vi forklare og demonstrere eksempel forberedelsene for kvasi-metagenomics analyse av Salmonella enterica fra representant mat og miljøprøver inkludert alfalfaspirer, bakken sort pepper, hakket biff, kylling bryst og miljømessige vattpinner. Eksempler er første utsatt for kultur anriking av Salmonella for en forkortet og justerbar varighet (4-24 h). Salmonella celler er selektivt erobret fra berikelse kulturen av immunomagnetic separasjon (IMS). Til slutt, flere forskyvning forsterkning (MDA) utføres for å forsterke DNA fra IMS-fanget celler. DNA resultatet av denne protokollen kan være rekkefølge av høy gjennomstrømning sekvensering plattformer. En valgfri kvantitative PCR analyse kan utføres for å erstatte sekvenser for Salmonella oppdagelsen eller vurdere konsentrasjonen av Salmonella DNA før sekvensering.
Metagenomics sekvensering kan teoretisk felles gjenkjennings- og subtyping av matbårne patogener. Men presentere mat prøver utfordringer til patogen analyse ved direkte sekvensering av mat microbiome. Først finnes matbårne patogener ofte på lave nivåer i mat prøver. De fleste kommersielt tilgjengelige rask påvisning metodene fortsatt krever 8 – 48 h dyrking perfeksjonerer patogen cellene til en synlig nivå1. Andre, mange matvarer inneholder rikelig mikroflora celler og/eller mat DNA, gjør matbårne patogen DNA en brøkdel av mat metagenome og en flyktig mål for gjenkjennings- og subtyping for direkte metagenomic sekvenser.
Endring av mat microbiomes har blitt rapportert at betydelig konsentrasjon av matbårne patogen DNA å lette sekvensering-basert oppdagelsen av Shiga toksin-produserende Escherichia coli2,3 og Salmonella enterica4. Fordi mat microbiomes er fortsatt blandinger av ulike mikrobielle arter, deres sekvensering er betegnet som kvasi-metagenomic analyse4. Microbiome endring kan utføres av kultur berikelse alene2,3 eller i kombinasjon med immunomagnetic separasjon (IMS) og flere forskyvning forsterkning (MDA)4,5. IMS kan selektivt fange patogen celler fra berikelse kulturen via antistoff magnetiske perler. MDA kan generere tilstrekkelig mengder genomisk DNA for sekvensering gjennom svært effektiv ɸ29 DNA polymerase6. IMS-MDA har tillatt kultur-uavhengig patogen oppdagelsen klinisk prøver7, forkortelse for kultur anriking for kvasi-metagenomic gjenkjenning og subtyping av Salmonella i mat prøver4.
Det overordnede målet med denne metoden er å forberede kvasi-metagenomic DNA fra mat prøver å tillate målrettet konsentrasjon av Salmonella genomisk DNA og påfølgende søk og subtyping av Salmonella miljøgifter av sekvenser. Sammenlignet med standard metoder for Salmonella oppdagelsen8,9 og subtyping10, kan quasimetagenomic tilnærming betraktelig forkorte tiden fra forurenset mat og miljøprøver til molekylær undergrupper av patogen ved å forene to vanligvis delt analyser i en enkelt arbeidsflyt. Denne metoden er spesielt nyttig for matbårne utbrudd svaret og andre spor tilbake undersøkelser der robust patogen subtyping kreves i tillegg patogen detection og rask analytisk produksjon er viktig.
Ofte lav overflod og i homogene tilstedeværelsen av Salmonella i mat og miljøprøver, kultur berikelse før IMS-MDA er fortsatt nødvendig for Salmonella gjenkjennings- og subtyping; Det er derfor en avgjørende skritt av protokollen. Finn optimale forhold øke overflod av Salmonella i forhold til prøven bakgrunn flora ved kan ulike berikelse media evalueres for bestemte prøver. Ifølge MLG og BAM, kan både selektiv medium som RV buljong og ikke-selektive medium som bufret pepton vann og l…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Mark Harrison og Gwen Hirsch av University of Georgia for vennlig å gi bakterielle belastningen og annen støtte til denne studien.
Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
50ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4C |
Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80C |
MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80C |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80C |
HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4C |
Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |