Summary

Kvasi-metagenomic analyse av Salmonella fra mat og miljøprøver

Published: October 25, 2018
doi:

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å forberede DNA-prøver fra mat og miljø microbiomes felles gjenkjennings- og subtyping av Salmonella gjennom quasimetagenomic sekvenser. Kombinert bruk av kultur berikelse, immunomagnetic separasjon (IMS) og flere forskyvning forsterkning (MDA) gir effektiv konsentrasjon av Salmonella genomisk DNA fra mat og miljøprøver.

Abstract

Quasi-metagenomics sekvensering refererer til sekvensering-basert analyse av modifisert microbiomes mat og miljøprøver. I denne protokollen, er microbiome modifisering designet for å konsentrere genomisk DNA av en målet matbårne patogen miljøgifter å lette oppdagelsen og subtyping av patogen i en enkelt arbeidsflyt. Her vi forklare og demonstrere eksempel forberedelsene for kvasi-metagenomics analyse av Salmonella enterica fra representant mat og miljøprøver inkludert alfalfaspirer, bakken sort pepper, hakket biff, kylling bryst og miljømessige vattpinner. Eksempler er første utsatt for kultur anriking av Salmonella for en forkortet og justerbar varighet (4-24 h). Salmonella celler er selektivt erobret fra berikelse kulturen av immunomagnetic separasjon (IMS). Til slutt, flere forskyvning forsterkning (MDA) utføres for å forsterke DNA fra IMS-fanget celler. DNA resultatet av denne protokollen kan være rekkefølge av høy gjennomstrømning sekvensering plattformer. En valgfri kvantitative PCR analyse kan utføres for å erstatte sekvenser for Salmonella oppdagelsen eller vurdere konsentrasjonen av Salmonella DNA før sekvensering.

Introduction

Metagenomics sekvensering kan teoretisk felles gjenkjennings- og subtyping av matbårne patogener. Men presentere mat prøver utfordringer til patogen analyse ved direkte sekvensering av mat microbiome. Først finnes matbårne patogener ofte på lave nivåer i mat prøver. De fleste kommersielt tilgjengelige rask påvisning metodene fortsatt krever 8 – 48 h dyrking perfeksjonerer patogen cellene til en synlig nivå1. Andre, mange matvarer inneholder rikelig mikroflora celler og/eller mat DNA, gjør matbårne patogen DNA en brøkdel av mat metagenome og en flyktig mål for gjenkjennings- og subtyping for direkte metagenomic sekvenser.

Endring av mat microbiomes har blitt rapportert at betydelig konsentrasjon av matbårne patogen DNA å lette sekvensering-basert oppdagelsen av Shiga toksin-produserende Escherichia coli2,3 og Salmonella enterica4. Fordi mat microbiomes er fortsatt blandinger av ulike mikrobielle arter, deres sekvensering er betegnet som kvasi-metagenomic analyse4. Microbiome endring kan utføres av kultur berikelse alene2,3 eller i kombinasjon med immunomagnetic separasjon (IMS) og flere forskyvning forsterkning (MDA)4,5. IMS kan selektivt fange patogen celler fra berikelse kulturen via antistoff magnetiske perler. MDA kan generere tilstrekkelig mengder genomisk DNA for sekvensering gjennom svært effektiv ɸ29 DNA polymerase6. IMS-MDA har tillatt kultur-uavhengig patogen oppdagelsen klinisk prøver7, forkortelse for kultur anriking for kvasi-metagenomic gjenkjenning og subtyping av Salmonella i mat prøver4.

Det overordnede målet med denne metoden er å forberede kvasi-metagenomic DNA fra mat prøver å tillate målrettet konsentrasjon av Salmonella genomisk DNA og påfølgende søk og subtyping av Salmonella miljøgifter av sekvenser. Sammenlignet med standard metoder for Salmonella oppdagelsen8,9 og subtyping10, kan quasimetagenomic tilnærming betraktelig forkorte tiden fra forurenset mat og miljøprøver til molekylær undergrupper av patogen ved å forene to vanligvis delt analyser i en enkelt arbeidsflyt. Denne metoden er spesielt nyttig for matbårne utbrudd svaret og andre spor tilbake undersøkelser der robust patogen subtyping kreves i tillegg patogen detection og rask analytisk produksjon er viktig.

Protocol

1. sample forberedelse Merk: Mat prøver er forberedt pre berikelse ifølge mikrobiologi laboratorium guidebok (MLG) av US Department of Agriculture mat Safety og inspeksjon Service (USDA-FSIS)11 og bakteriologiske analytisk manuell (BAM) av US Food og Drug Administration (FDA)12. Tas aseptisk plassere en 25 g del av mat prøve som sort pepper, kyllingbryst, kjøttdeig, og alfalfaspirer eller en miljømessig vattpinnen i et sterilt labo…

Representative Results

Før quasimetagenomic sekvensering, kan total mengde og renhet av IMS-MDA produkter bli vurdert av fluorospectrometer (tabell 1). Berikelse tid (h) CT verdi Konsentrasjonen (ng/ul) Renhet (260/280) Merke A</td…

Discussion

Ofte lav overflod og i homogene tilstedeværelsen av Salmonella i mat og miljøprøver, kultur berikelse før IMS-MDA er fortsatt nødvendig for Salmonella gjenkjennings- og subtyping; Det er derfor en avgjørende skritt av protokollen. Finn optimale forhold øke overflod av Salmonella i forhold til prøven bakgrunn flora ved kan ulike berikelse media evalueres for bestemte prøver. Ifølge MLG og BAM, kan både selektiv medium som RV buljong og ikke-selektive medium som bufret pepton vann og l…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gjerne takke Mark Harrison og Gwen Hirsch av University of Georgia for vennlig å gi bakterielle belastningen og annen støtte til denne studien.

Materials

Laboratory blender bag w/filter VWR 10048-886
Buffered peptone water Oxoid Micorbiology Products CM0509
Rappaport Vassiliadis broth Neogen Acumedia 7730A
Polysorbate 20  Millipore Sigma P9416 Tween 20
Stomacher blender Seward  30010108
Centrifuge Fisher Scientific 75005194
50ml Centrifuge tubes Fisher Scientific 05-539-6
Thermal Cycler Techne Prime EW-93945-13
StepOne Real-Time Thermal cycler Applied Biosystems 4.76357
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 PCR purification beads; mix well before use; store at 4C
Nextera XT library prep kit Illumina FC-131-1024 Store at -80C
MinIon library prep kit Oxford Nanopore SQK-LSK108 Store at -80C
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000
Dynabead Anti-Salmonella beads Applied Biosystems 71002 Vortex well prior to use
Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit)
-Sample buffer
-Reaction buffer
-Enzyme mix
GE Healthcare 25-6600-30 Store at -80C
HulaMixer Invitrogen 15920D
DynaMag magnetic rack Invitrogen 12321D
TaqMan Universal PCR mastermix Applied Biosystems 4304437 Mix well before use; store at 4C
Microfuge Fisher Scientific 05-090-100

Referências

  1. Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., & Cutter, C. N. Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).
  2. Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., & Elkins, C. A. Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).
  3. Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., & Elkins, C. A. Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing. PLoS One. 11 (12), e0167870 (2016).
  4. Hyeon, J. Y. et al. Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples. Applied and Environmental Microbiology. (2017).
  5. Hyeon, J. Y., & Deng, X. Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification. Food Microbiology. 63 111-116 (2017).
  6. Hosono, S. et al. Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples. Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).
  7. Seth-Smith, H. M. et al. Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture. Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).
  8. Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., & Hammack, T. S. Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method. Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).
  9. Jacobson, A. P., Hammack, T. S., & Andrews, W. H. Evaluation of sample preparation methods for the isolation of Salmonella from alfalfa and mung bean seeds with the Bacteriological Analytical Manual's Salmonella culture method. Journal of AOAC International. 91 (5), 1083-1089 (2008).
  10. Deng, X. et al. Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).
  11. Anonymous. Microbiology Laboratory Guidebook. <www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook> (2018).
  12. Andrews, W. H., Wang, H., Jacobson, A., & Hammack, T. Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella., <www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm> (2018).
  13. Malorny, B. et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).
  14. June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., & Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study. Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).
  15. Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., & Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load. Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).
  16. Wood, D. E., & Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), R46 (2014).
  17. Davis S, P. J., Luo Y, Payne J, Shpuntoff A, Rand H, Strain E. CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data. PeerJ Computer Science. 1 (e20) (2015).
  18. Zhang, S. et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).
  19. Rodrigue, S. et al. Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells. PLoS One. 4 (9), e6864 (2009).
  20. Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., & Shinoda, S. Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria. Front Public Health. 2, 103 (2014).
check_url/pt/58612?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Hyeon, J., Mann, D. A., Townsend, A. M., Deng, X. Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples. J. Vis. Exp. (140), e58612, doi:10.3791/58612 (2018).

View Video