Квази метагеномных анализ сальмонеллы от пищевых продуктов и экологические пробы
Summary
Здесь мы представляем протокол подготовить образцы ДНК от продуктов питания и окружающей среды microbiomes для согласованных обнаружения и подтипов сальмонеллы через quasimetagenomic последовательности. Комбинированное использование обогащения культуры, иммуномагнитная разделения (IMS) и несколько перемещения амплификации (MDA) позволяет эффективная концентрация сальмонеллы геномной ДНК от пищевых продуктов и экологические пробы.
Abstract
Quasi метагеномики последовательности относится к последовательности на основе анализа модифицированных microbiomes продовольствия и проб окружающей среды. В этом протоколе микрофлора модификация предназначена для сконцентрировать геномной ДНК для облегчения обнаружения целевой пищевого происхождения патогенных загрязнителей и подтипов возбудителя в одном рабочем процессе. Здесь, мы объяснить и продемонстрировать шаги подготовки образцов для анализа квази метагеномики Salmonella enterica от представителя Продовольственной и проб окружающей среды, включая ростки люцерны, молотый черный перец, говяжий фарш, куриные груди и экологические тампоны. Первые образцы подвергаются обогащения культуры сальмонеллы укороченные и регулируемая длительность (4 – 24 ч). Сальмонелла клетки затем выборочно захватываются от обогащения культуры иммуномагнитная разделения (IMS). Наконец для того чтобы усилить дна от клеток, IMS-захватили выполняется несколько перемещения амплификации (MDA). ДНК вывода этого протокола можно упорядочивать по высокой пропускной способности виртуализации платформ. Необязательный количественный анализ ПЦР может выполняться заменить последовательности для обнаружения сальмонеллы или оценить концентрацию сальмонеллы ДНК до последовательности.
Introduction
Секвенирование метагеномики теоретически позволяет согласованные обнаружения и подтипов пищевых патогенов. Однако проб продуктов питания создают проблемы для анализа возбудителя путем прямого секвенирования микрофлора пищи. Во-первых пищевых патогенов часто присутствуют на низких уровнях в образцах пищевых продуктов. Большинство коммерчески доступных быстрое обнаружение методов по-прежнему требуют 8 – 48 ч культивирования для обогащения клеток возбудителя к обнаружению уровня1. Во-вторых многие продукты содержат обильной микрофлоры клеток и/или пищи ДНК, делая ДНК возбудителя пищевого небольшая еда metagenome и недостижимой цели для обнаружения и подтипов, прямые метагеномных последовательности.
Модификация microbiomes пищи было сообщено позволить значительные концентрации пищевых патогенов ДНК для облегчения обнаружения на основе последовательности Сига производства токсина кишечная палочка2,3 и Salmonella enterica4. Потому что модифицированные продукты microbiomes по-прежнему смеси различных видов микроорганизмов, их последовательность называют квази метагеномных анализ4. Микрофлора модификация может выполняться путем обогащения культуры только2,3 или в комбинации с иммуномагнитная разделением (IMS) и несколько перемещения амплификации (MDA)4,5. IMS может выборочно захватить возбудителя клетки от обогащения культуры через антителами магнитные бусы. MDA можно создавать достаточное количество геномной ДНК для секвенирования через ДНК полимеразы высокоэффективных ɸ296. IMS-MDA позволяет обнаружения зависящих от культуры возбудителя из клинических образцов7и сокращение обогащения культуры для обнаружения квази метагеномных и подтипов сальмонеллы в пищевой образцы4.
Общая цель этого метода-подготовить квази metagenomic ДНК из проб продуктов питания целевых концентрация сальмонеллы геномной ДНК и последующего обнаружения и подтипов сальмонеллы загрязнителей путем sequencing. По сравнению с стандартными методами для обнаружения сальмонеллы 8,9 и подтипов10, quasimetagenomic подход существенно может сократить время обработки загрязненных пищевых продуктов и экологические пробы для молекулярные подтипы возбудителя, объединяющей два обычно разделены анализы на один рабочий процесс. Этот метод особенно полезен для таких ответных действий на вспышку пищевого происхождения и другие трассировки обратно расследования где надежный возбудитель подтипов требуется Помимо обнаружения возбудителя и важен быстрый поворот аналитических приложений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Из-за изобилия часто низкий и в однородных присутствие в продуктах питания и окружающей среды образцы сальмонеллы обогащение культуры до IMS-MDA все еще необходим для обнаружения сальмонеллы и подтипов; Именно поэтому важнейшим шагом протокола. Чтобы определить оптимальные усл…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Марк Харрисон и Гвен Hirsch университета Грузии за любезно бактериальный штамм и другой поддержки для этого исследования.
Materials
| Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
| Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
| Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
| Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
| Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
| 50ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
| Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
| StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4C |
| Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80C |
| MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80C |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
| Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80C |
| HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
| DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4C |
| Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |
Referências
- Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., Cutter, C. N. Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing. PLoS One. 11 (12), e0167870 (2016).
- Hyeon, J. Y., et al. Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
- Hyeon, J. Y., Deng, X. Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification. Food Microbiology. 63, 111-116 (2017).
- Hosono, S., et al. Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples. Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).
- Seth-Smith, H. M., et al. Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture. Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).
- Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., Hammack, T. S. Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method. Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).
- Jacobson, A. P., Hammack, T. S., Andrews, W. H. Evaluation of sample preparation methods for the isolation of Salmonella from alfalfa and mung bean seeds with the Bacteriological Analytical Manual’s Salmonella culture method. Journal of AOAC International. 91 (5), 1083-1089 (2008).
- Deng, X., et al. Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).
- . Microbiology Laboratory Guidebook Available from: https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook (2018)
- . Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella Available from: https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm (2018)
- Malorny, B., et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).
- June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study. Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).
- Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load. Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).
- Wood, D. E., Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), R46 (2014).
- Davis, S., Pettengill, J. B., Luo, Y., Payne, J., Shpuntoff, A., Rand, H., Strain, E. CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data. PeerJ Computer Science. 1 (e20), (2015).
- Zhang, S., et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).
- Rodrigue, S., et al. Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells. PLoS One. 4 (9), e6864 (2009).
- Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., Shinoda, S. Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria. Front Public Health. 2, 103 (2014).
