Análisis de metagenómica cuasi de Salmonella de muestras alimentarias y ambientales
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para preparar muestras de ADN de alimentos y medio ambiente microbiomes de detección concertada y subclasificación de Salmonella a través de la secuencia quasimetagenomic. El uso combinado de enriquecimiento de la cultura, la separación inmunomagnética (IMS) y múltiples desplazamiento amplificación (MDA) permite la concentración efectiva de la DNA genomic de la Salmonella de muestras alimentarias y ambientales.
Abstract
Cuasi-metagenómica secuenciación se refiere al análisis basado en la secuencia de microbiomes modificado de muestras alimentarias y ambientales. En este protocolo, modificación de microbioma está diseñado para concentrar el ADN genómico de un contaminante de patógeno de los alimentos objetivo para facilitar la detección y la subclasificación del patógeno en un único flujo de trabajo. Aquí, explicar y demostrar los pasos de preparación de muestra para el análisis de metagenómica cuasi de enterica de las salmonelas de representativas muestras alimentarias y ambientales incluyendo brotes de alfalfa, pimienta negra molida, carne picada, pechuga de pollo y de medio ambiente. Las muestras primero son sometidas al enriquecimiento de la cultura de Salmonella para una duración acortada y ajustable (4 – 24 h). Células de Salmonella son selectivamente capturadas de la cultura de enriquecimiento por separación inmunomagnética (IMS). Finalmente, se realiza amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) para amplificar ADN de células capturadas de IMS. La salida del ADN de este protocolo puede ordenada por plataformas de secuenciación de alto rendimiento. Un análisis PCR cuantitativo opcional puede realizarse para cambiar la secuencia para la detección de Salmonella o evaluar la concentración de Salmonella ADN antes de la secuencia.
Introduction
Secuencia de la metagenómica permite teóricamente detección concertada y subclasificación de patógenos alimentarios. Sin embargo, muestras de alimentos presentan desafíos para el análisis de patógenos por la secuencia directa de la microbioma de la comida. En primer lugar, patógenos de transmisión alimentaria a menudo están presentes en niveles bajos en muestras de alimentos. La mayoría de los métodos de detección rápida disponible comercialmente aún requieren 8 – 48 h de cultivo para enriquecer las células del patógeno a un nivel detectable1. En segundo lugar, muchos alimentos contienen células abundante microflora o alimentos ADN, haciendo ADN de patógenos de transmisión alimentaria una pequeña fracción del metagenoma de alimentos y un objetivo difícil de alcanzar para detección y subclasificación por dirigen secuencia de metagenómica.
Modificación de microbiomes de alimentos se ha divulgado para permitir la concentración sustancial de patógeno de los alimentos ADN para facilitar la detección basada en la secuencia de Shiga Escherichia coliproductoras de toxina2,3 y Enterica de las salmonelas4. Porque alimentos microbiomes todavía son mezclas de diferentes especies microbianas, su secuencia se denomina como análisis de metagenómica casi4. Microbioma modificación puede realizarse por cultura enriquecimiento solo2,3 o en combinación con separación inmunomagnética (IMS) y múltiples desplazamientos amplificación (MDA)4,5. IMS puede capturar selectivamente las células del patógeno de la cultura del enriquecimiento a través de granos magnéticos recubiertos de anticuerpos. MDA puede generar cantidades suficientes de la DNA genomic de la secuencia a través de la polimerasa de la DNA ɸ29 altamente eficiente del6. IMS-MDA ha permitido la detección de patógenos de la cultura-independiente de las muestras clínicas7y acortamiento del enriquecimiento de la cultura para la detección de cuasi metagenómica y subclasificación de Salmonella en muestras de alimentos4.
El objetivo general de este método es preparar cuasi metagenomic ADN de muestras de alimentos para permitir la concentración específica de ADN genómico de Salmonella y posterior detección y subclasificación de los contaminantes de la Salmonella por la secuencia. En comparación con los métodos estándar para detección de Salmonella 8,9 y10de subclasificación, el enfoque quasimetagenomic puede acortar substancialmente el tiempo de procesamiento de alimentos contaminados y muestras ambientales a subtipos moleculares del patógeno por unificar los dos típicamente separan análisis en un único flujo de trabajo. Este método es particularmente útil para aplicaciones como respuesta de brote de origen alimentario y otras investigaciones posterior del rastro donde sólido patógeno subclasificación se requiere además de detección de patógenos y rápida renovación analítica es importante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Debido a la abundancia de frecuencia baja y homogénea en presencia de Salmonella en muestras alimentarias y ambientales, enriquecimiento de la cultura antes de IMS-MDA es necesario para la detección de Salmonella y subclasificación; por lo tanto es un paso crítico del protocolo. Para identificar las condiciones óptimas para incrementar la abundancia de Salmonella con respecto a la flora del fondo de muestra, pueden evaluar los medios de enriquecimiento diferentes muestras específicas. Seg…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Mark Harrison y Gwen Hirsch de la Universidad de Georgia para proporcionar amablemente la cepa bacteriana y otro tipo de apoyo a este estudio.
Materials
| Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
| Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
| Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
| Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
| Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
| 50ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
| Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
| StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4C |
| Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80C |
| MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80C |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
| Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80C |
| HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
| DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4C |
| Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |
Referências
- Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., & Cutter, C. N. Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., & Elkins, C. A. Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., & Elkins, C. A. Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing. PLoS One. 11 (12), e0167870 (2016).
- Hyeon, J. Y. et al. Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples. Applied and Environmental Microbiology. (2017).
- Hyeon, J. Y., & Deng, X. Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification. Food Microbiology. 63 111-116 (2017).
- Hosono, S. et al. Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples. Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).
- Seth-Smith, H. M. et al. Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture. Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).
- Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., & Hammack, T. S. Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method. Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).
- Jacobson, A. P., Hammack, T. S., & Andrews, W. H. Evaluation of sample preparation methods for the isolation of Salmonella from alfalfa and mung bean seeds with the Bacteriological Analytical Manual's Salmonella culture method. Journal of AOAC International. 91 (5), 1083-1089 (2008).
- Deng, X. et al. Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).
- Anonymous. Microbiology Laboratory Guidebook. <www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook> (2018).
- Andrews, W. H., Wang, H., Jacobson, A., & Hammack, T. Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella., <www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm> (2018).
- Malorny, B. et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).
- June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., & Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study. Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).
- Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., & Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load. Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).
- Wood, D. E., & Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), R46 (2014).
- Davis S, P. J., Luo Y, Payne J, Shpuntoff A, Rand H, Strain E. CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data. PeerJ Computer Science. 1 (e20) (2015).
- Zhang, S. et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).
- Rodrigue, S. et al. Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells. PLoS One. 4 (9), e6864 (2009).
- Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., & Shinoda, S. Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria. Front Public Health. 2, 103 (2014).
