Quasi-gjorts analys av Salmonella från mat och miljöprover
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att förbereda DNA-prover från mat och miljö microbiomes för samordnade upptäckt och subtypning av Salmonella genom quasimetagenomic-sekvensering. Den kombinerade användningen av kultur berikning, immunmagnetisk separation (IMS) och flera deplacement amplifiering (MDA) tillåter effektiv koncentration av Salmonella genomisk DNA från livsmedels- och miljöprov.
Abstract
Quasi-metagenomik sekvensering avser sekvensering-baserad analys av modifierade microbiomes av mat och miljöprover. I detta protokoll syftar mikrobiomet ändring till att koncentrera genomiskt DNA av en target livsmedelsburna patogener förorening att underlätta upptäckten och subtypning av patogenet i ett enda arbetsflöde. Här, vi förklara och demonstrera provberedningssteg för quasi-metagenomik analys av Salmonella enterica från representativa mat och miljöprover inklusive alfalfagroddar, mald svartpeppar, mald nöt, kyckling bröst och miljömässiga kompresser. Prover först utsätts för kultur anrikningen av Salmonella för en förkortad och justerbar varaktighet (4 – 24 h). Salmonella celler fångas sedan selektivt från anrikning kulturen av immunmagnetisk separation (IMS). Slutligen utförs flera deplacement amplifiering (MDA) för att förstärka DNA från IMS-tagna celler. DNA utdata i detta protokoll kan sekvenseras av hög genomströmning sekvensering plattformar. En valfri kvantitativa PCR analys kan utföras för att ersätta sekvensering för Salmonella upptäckt eller bedöma koncentrationen av Salmonella DNA innan sekvensering.
Introduction
Metagenomik sekvensering kan teoretiskt samordnade upptäckt och subtypning av livsmedelsburna patogener. Men presenterar mat prover utmaningar till patogen analysen av sekvensering av den mat mikrobiomet. Först, livsmedelsburna patogener är ofta närvarande på låga nivåer i mat prover. De flesta kommersiellt tillgängliga snabb upptäckt metoder fortfarande kräva 8 – 48 h odling för att berika patogen celler till en detekterbar nivå1. För det andra, många livsmedel innehåller riklig mikroflora celler eller mat DNA, att göra livsmedelsburna patogener DNA en bråkdel av mat metagenome och ett gäckande mål för upptäckt och subtypning av direkt gjorts sekvensering.
Ändring av mat microbiomes har rapporterats att möjliggöra betydande koncentration av livsmedelsburna patogener DNA att underlätta sekvensering-baserad detektion av Shiga toxinproducerande Escherichia coli2,3 och Salmonella enterica4. Eftersom modifierade livsmedel microbiomes fortfarande blandningar av olika mikrobiella arter, deras sekvensering är betecknas som quasi-gjorts analys4. Mikrobiomet modifiering kan utföras genom kultur anrikning ensam2,3 eller i kombination med immunmagnetisk separation (IMS) och flera deplacement amplifiering (MDA)4,5. IMS kan selektivt fånga patogen celler från berikande kultur via antikroppsbelagda magnetiska pärlor. MDA kan generera tillräckliga mängder genomiskt DNA för sekvensering genom högeffektiva ɸ29 DNA-polymeras6. IMS-MDA har tillåtit från kliniska prover7, och förkortning av kultur berikning för quasi-gjorts upptäckt och subtypning av Salmonella i livsmedel prover4upptäckt av kultur-oberoende patogen.
Det övergripande målet med denna metod är att förbereda quasi-metagenomic DNA från mat prover att möjliggöra riktade koncentrationen av Salmonella genomiskt DNA och efterföljande detektion och subtypning av det främmande ämnet på Salmonella av sekvensering. Jämfört med standardmetoder för Salmonella upptäckt8,9 och subtypning10, kan metoden quasimetagenomic väsentligen förkorta handläggningstiden från förorenad mat och miljöprover till molekylära subtyper av patogener genom att förena två vanligtvis separeras analyser i ett enda arbetsflöde. Denna metod är särskilt användbar för applikationer såsom livsmedelsburna utbrott svar och andra spår tillbaka utredningar där robust patogen subtypning krävs förutom upptäckt av patogen och snabba analytiska vändning är viktigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund av ofta låg överflöd och i-homogen förekomsten av Salmonella i livsmedel och miljöprover, kultur anrikning före IMS-MDA är fortfarande nödvändigt för Salmonella upptäckt och subtypning; Det är därför ett viktigt steg i protokollet. För att identifiera optimala förutsättningar att öka överflödet av Salmonella i förhållande till provets bakgrund flora, kan olika anrikning media utvärderas för specifika prover. Enligt MLG och BAM, kan både selektivt medium såsom…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Mark Harrison och Gwen Hirsch av University of Georgia för vänligt att ge bakteriestam och andra stöd till denna studie.
Materials
| Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
| Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
| Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
| Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
| Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
| 50ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
| Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
| StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4C |
| Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80C |
| MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80C |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
| Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80C |
| HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
| DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4C |
| Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |
Referências
- Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., & Cutter, C. N. Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., & Elkins, C. A. Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., & Elkins, C. A. Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing. PLoS One. 11 (12), e0167870 (2016).
- Hyeon, J. Y. et al. Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples. Applied and Environmental Microbiology. (2017).
- Hyeon, J. Y., & Deng, X. Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification. Food Microbiology. 63 111-116 (2017).
- Hosono, S. et al. Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples. Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).
- Seth-Smith, H. M. et al. Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture. Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).
- Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., & Hammack, T. S. Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method. Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).
- Jacobson, A. P., Hammack, T. S., & Andrews, W. H. Evaluation of sample preparation methods for the isolation of Salmonella from alfalfa and mung bean seeds with the Bacteriological Analytical Manual's Salmonella culture method. Journal of AOAC International. 91 (5), 1083-1089 (2008).
- Deng, X. et al. Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).
- Anonymous. Microbiology Laboratory Guidebook. <www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook> (2018).
- Andrews, W. H., Wang, H., Jacobson, A., & Hammack, T. Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella., <www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm> (2018).
- Malorny, B. et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).
- June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., & Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study. Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).
- Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., & Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load. Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).
- Wood, D. E., & Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), R46 (2014).
- Davis S, P. J., Luo Y, Payne J, Shpuntoff A, Rand H, Strain E. CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data. PeerJ Computer Science. 1 (e20) (2015).
- Zhang, S. et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).
- Rodrigue, S. et al. Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells. PLoS One. 4 (9), e6864 (2009).
- Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., & Shinoda, S. Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria. Front Public Health. 2, 103 (2014).
