Metagenomic yarı analiz Salmonella gıda ve çevre örnekleri
Summary
Burada, gıda ve çevre microbiomes DNA örnekleri uyumlu algılama ve Salmonella quasimetagenomic sıralama yoluyla subtyping hazırlamak için bir iletişim kuralı mevcut. Kombine kullanım kültürü zenginleştirme, immunomagnetic ayrılık (IMS) ve birden çok deplasman amplifikasyon (MDA) Gıda ve çevre örnekleri Salmonella genomik DNA’ın etkili konsantrasyon sağlar.
Abstract
Sözde metagenomics sıralama değiştirilmiş microbiomes gıda ve çevre örnekleri sıralama tabanlı analiz eder. Bu protokol için microbiome değişiklik algılama kolaylaştırmak için genomik DNA’ın çifte bir hedef gıda kaynaklı patojen kirletici ve tek iş akışında patojen subtyping konsantre için tasarlanmıştır. Burada, biz açıklamak ve göstermek Salmonella enterica yarı metagenomics analiz temsilcisi gıda ve çevre örnek yonca filizi, dahil için örnek hazırlanması adım karabiber zemin, zemin sığır eti, tavuk göğsü ve çevresel temizleme bezi. Örnekleri ilk Salmonella kültürü zenginleştirme bir süre kısaltılmış ve ayarlanabilir (4 – 24 h) tabi. Salmonella hücreleri zenginleştirme kültüründen immunomagnetic ayrılık (IMS) seçmeli olarak yakalanır. Son olarak, birden çok deplasman amplifikasyon (MDA) IMS yakalanan hücrelerden DNA yükseltmek için gerçekleştirilir. Bu iletişim kuralı DNA çıktısını yüksek işlem hacmi sıralama platformları tarafından sıralı. İsteğe bağlı bir kantitatif PCR analiz Salmonella algılama için sıralama değiştirme veya sıralama önce Salmonella DNA konsantrasyonu değerlendirmek için gerçekleştirilebilir.
Introduction
Metagenomics sıralama teorik olarak uyumlu algılama ve gıda kaynaklı patojenler subtyping sağlar. Ancak, gıda örnekleri gıda microbiome doğrudan sıralama tarafından patojen analiz için sorunlar mevcut. İlk olarak, gıda kaynaklı patojenler düşük seviyelerde gıda örnekleri mevcut çoğu kez. Çoğu hala piyasada bulunan hızlı algılama yöntemleri, 8-48 h patojen tespit düzey1hücrelere zenginleştirmek için kültür gerektirir. İkinci olarak, birçok gıdalar içeren bol mikrofloranın hücreleri ve/veya gıda DNA, algılama ve subtyping tarafından metagenomic sıralama yolu tarif etmek için gıda kaynaklı patojen DNA gıda metagenome ve zor bir hedef küçük bir kısmını yapma.
Gıda microbiomes modifikasyonu gıda kaynaklı patojen DNA sıralama tabanlı algılama Shiga toksin üreten Escherichia coli2,3 ve kolaylaştırmak için önemli konsantrasyon izin bildirilmiştir Salmonella enterica4. Çünkü gıda modifiye microbiomes hala karışımları farklı mikrobiyal türlerin, onların sıralama yarı metagenomic analiz4adlandırılır. Microbiome değişiklik veya immunomagnetic ayrılık (IMS) ile birlikte ve birden çok deplasman amplifikasyon (MDA)4,5kültürü zenginleştirme yalnız2,3 tarafından gerçekleştirilebilir. IMS antikor kaplı manyetik boncuklar ile zenginleştirme kültüründen patojen hücreleri seçerek yakalayabilirsiniz. MDA genomik DNA sıralama ile yüksek verimli ɸ29 DNA polimeraz6için yeterli miktarda oluşturabilirsiniz. IMS-MDA kültür bağımsız patojen algılama klinik örnekler7ve metagenomic yarı algılama için kültür kendilerini zenginleştirmek kısalma ve Salmonella gıda örnekleri4‘ subtyping izin verdi.
Bu yöntem genel amacı gıda örnekleri metagenomic yarı DNA’dan Salmonella genomik DNA ve sonraki algılama hedeflenen konsantrasyon ve Salmonella kirletici sıralama tarafından subtyping izin vermek için hazırlamaktır. Salmonella algılama8,9 standart yöntemleri ile karşılaştırıldığında ve10subtyping quasimetagenomic yaklaşım kontamine gıda ve çevre örnekleri için gerçekleştirme süresi önemli ölçüde kısaltabilir genellikle iki birleştirici tarafından patojen moleküler alt türlerinden analizleri tek bir iş akışı içine ayrılmış. Bu yöntem özellikle gıda kaynaklı outbreak yanıt ve sağlam patojen subtyping patojen algılama ek olarak gereklidir ve hızlı analitik dönüş önemli olduğu yerde diğer izleme arka araştırmalar gibi uygulamalar için kullanışlıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genellikle düşük bereket ve gıda ve çevre örnekleri Salmonella içinde homojen varlığı nedeniyle, kültür zenginleştirme IMS-MDA önce yine Salmonella algılama ve subtyping için gereklidir; Bu nedenle iletişim kuralının kritik bir adımdır. Salmonella bereket örnek arka plan flora göre artırmak için en uygun koşulları tanımlamak için farklı zenginleştirme medya belirli örnekler için değerlendirilecek. MLG ve BAM göre RV suyu gibi Seçmeli Orta ve tamponlu pepton s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazar Mark Harrison ve Gwen Hirsch Georgia Üniversitesi nazikçe bakteriyel zorlanma ve bu çalışma için diğer destek sağlamak için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
| Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
| Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
| Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
| Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
| 50ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
| Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
| StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4C |
| Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80C |
| MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80C |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
| Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80C |
| HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
| DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4C |
| Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |
Referências
- Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., Cutter, C. N. Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing. PLoS One. 11 (12), e0167870 (2016).
- Hyeon, J. Y., et al. Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
- Hyeon, J. Y., Deng, X. Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification. Food Microbiology. 63, 111-116 (2017).
- Hosono, S., et al. Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples. Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).
- Seth-Smith, H. M., et al. Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture. Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).
- Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., Hammack, T. S. Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method. Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).
- Jacobson, A. P., Hammack, T. S., Andrews, W. H. Evaluation of sample preparation methods for the isolation of Salmonella from alfalfa and mung bean seeds with the Bacteriological Analytical Manual’s Salmonella culture method. Journal of AOAC International. 91 (5), 1083-1089 (2008).
- Deng, X., et al. Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).
- . Microbiology Laboratory Guidebook Available from: https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook (2018)
- . Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella Available from: https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm (2018)
- Malorny, B., et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).
- June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study. Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).
- Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load. Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).
- Wood, D. E., Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), R46 (2014).
- Davis, S., Pettengill, J. B., Luo, Y., Payne, J., Shpuntoff, A., Rand, H., Strain, E. CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data. PeerJ Computer Science. 1 (e20), (2015).
- Zhang, S., et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).
- Rodrigue, S., et al. Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells. PLoS One. 4 (9), e6864 (2009).
- Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., Shinoda, S. Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria. Front Public Health. 2, 103 (2014).
