Aqui, nós descrevemos métodos da manipulação optogenética de tipos particulares de neurônios durante a monitoração de Estados do sono/wakefulness nos ratos, apresentando nosso trabalho recente no núcleo da cama do terminalis do stria como um exemplo.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Manipulação optogenetic de circuitos neural durante a monitoração sono/Estados do wakefulness nos ratos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nos últimos anos, a optogenética tem sido amplamente utilizada em muitos campos da pesquisa neurocientífica. Em muitos casos, um opsin, tal como a canaleta rodopsina 2 (ChR2), é expressado por um vetor do vírus em um tipo particular de pilhas neuronal em vários ratos do CRE-excitador. A ativação desses opsinas é desencadeada pela aplicação de pulsos leves que são entregues por laser ou LED através de cabos ópticos, e o efeito da ativação é observado com resolução de tempo muito alta. Os experimentadores são capazes de estimular agudamente os neurônios enquanto monitoram o comportamento ou outro resultado fisiológico em camundongos. A optogenética pode permitir estratégias úteis para avaliar a função dos circuitos neuronais na regulação dos Estados de sono/vigília em camundongos. Aqui nós descrevemos uma técnica para examinar o efeito da manipulação optogenética dos neurônios com uma identidade química específica durante o eletroencefalograma (EEG) e a monitoração do electromyogram (EMG) para avaliar o estágio do sono dos ratos. Como um exemplo, nós descrevemos a manipulação de neurônios GABAergic no núcleo da cama do terminalis do stria (BNST). A excitação optogenética aguda desses neurônios desencadeia uma rápida transição para a vigília quando aplicada durante o sono NREM. A manipulação optogenetic junto com a gravação de EEG/EMG pode ser aplicada para decifrar os circuitos neuronal que regulam Estados do sono/wakefulness.
Introdução
O sono é essencial para a função cognitiva ideal. Achados recentes também sugerem que distúrbios no sono estão associados a uma ampla gama de doenças1,2,3. Embora as funções do sono sejam ainda largamente não resolvidas, o progresso substancial foi feito recentemente em compreender os circuitos e os mecanismos neural que controlam Estados do sono/vigília4. Nos mamíferos, há três Estados de vigilância: vigília, sono não-rápido do movimento de olho (NREM), e sono rápido do movimento de olho (REM). A vigília é caracterizada por oscilações rápidas de EEG (....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os experimentos aqui foram aprovados pelo Comitê de experimentação e uso de animais da Universidade de Tsukuba, cumprindo as diretrizes da NIH.
1. cirurgia animal, injeção de vírus, eletrodo para EEG/EMG, e implante de fibra óptica
Atenção: Devem ser seleccionadas técnicas adequadas de protecção e manuseamento, com base no nível de biossegurança do vírus a ser utilizado. O AAV deve ser usado em um quarto isolado P1A classific para a injeção, e o tubo que carreg AAV deve ser sterilized com uma autoclave depois que todo o volume é usado acima. O local cirúrgico e todo o material implant....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O estudo atual mostrou o efeito da excitação optogenética de neurônios de GABABNST na transição do estado de sono. ChR2-EYFP foi expressado focal em neurônios de GABA no BNST. Um estudo Histochemical in situ da hibridação mostrou que ChR2-EYFP estêve colocalizado nos neurônios que expressam o GAD 67 sinais do mRNA, indicando que estes são os neurônios GABAergic. As amostras da fatia de immunohistochemical confirmaram a posição da fibra ótica, cuja a ponta era apenas acima do BN.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Nós apresentamos aqui um método para avaliar o efeito da estimulação optogenética dos neurônios com as identidades químicas particulares em transições do estado do sono/vigília e deu um exemplo da manipulação de neurônios de GABABNST . Nossos dados mostraram que a excitação optogenética de neurônios de GABABNST conduz à transição imediata do sono de NREM ao wakefulness.
Os vários projetos experimentais estão disponíveis por causa do desenvolvimento de tipos numerosos de f.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Este projeto foi parcialmente apoiado financeiramente pela Merck & Co.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pelo programa de estudos do investigador da Merck (#54843), um subsídio de ajuda de KAKENHI para pesquisa científica sobre áreas inovadoras, "WillDynamics" (16H06401) (TS), e um subsídio de KAKENHI para pesquisa exploratória em áreas inovadoras (TS) (18H02595).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1x1 Juntas Rotativas de Fibra Óptica | Doric | FRJ 1x1 FC-FC | para optogenética |
| Cabeçalho de 6 pinos | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| Soquete de 6 pinos | Hirose | 21602X3GSE | |
| Conversor A/D | Nippon koden | N/A | Conversor analógico para digital |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3,70 vezes; 1013(cópias genômicas/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5,82&vezes; 1013 (cópias genômicas/ml) | ||
| Ampicilina | Fuji filme | 014-23302 | |
| Amplificador | Nippon koden | N / A | para gravação de EEG / EMG |
| Vaporizador anestésico | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Injetador automático | KD científico | 780311 | |
| cortador de carboneto | Minitor | B1055 | φ 0,7 mm. Referido como broca dental, usado com micromotor rotativo de alta velocidade |
| Adesão de cianoacrilato (Aron alfa A) e aceleração | Konishi | # 30533 | |
| Luz de polimerização dental | 3M | Elipar S10 | |
| Adesivo epóxi | Konishi | # 04888 | isolamento ao redor da solda de 6 pinos e cabo blindado Cabo de |
| remendo de fibra óptica (ramificação) | Doric | BFP (#) _50/125 / 900-0,22 | |
| < em> Gad67 < / em>-Cre | fornecido pelo Dr. Kenji Sakimura | O gene Cre recombinase é introduzido no alelo Gad67 Seringa | |
| de micromotor rotativo de alta velocidade | Hamilton | Usado com cortador de carboneto | |
| Cerâmica de 2,5 mm | |||
| Isoflurano | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473 nm comprimento de onda |
| Verificador de intensidade a laser | COERENTE | 1098293 | |
| Estimulador a laser | Bio research center | STO2 | referido como gerador de pulso em texto |
| Fibra óptica com ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | fornecido por PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | fornecido pelo Dr. Karl Deisseroth | ||
| Cabo de remendo | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m de comprimento, condutor de laser entre laser e junta rotativa |
| pHelper | Stratagene | ||
| Cimento dentário fotocurável | 3M | 56846 | |
| Braçadeira Serafin | Stoelting | 52120-43P | |
| Cabo blindado | mogami | W2780 | Solda a soquete de 6 pinos para gravação de EEG/EMG |
| Câmara de gravação do sono | N/A | N/A | Feito sob medida (21 cm× 29 cm × 19 cm) com suporte para tanque de água |
| Software de sinal de sono | KISSEI COMTEC | N/A | para análise de EEG/EMG |
| Anel deslizante | neuroscience,inc | N/A | para análise de EEG/EMG |
| Parafuso de aço inoxidável | Yamazaki | N/A | φ 1.0 x 2.0 |
| Fio inoxidável | Fio Cooner | AS633 | 0,0130 polegadas de diâmetro |
| quadro estereotáxico com console digital | Koph | N / A | Modelo 940 |
| Agulha de seringa | Hamilton | 7803-05 | |
| Software gravador vital | KISSEI COMTEC | N / A | para gravação de EEG / EMG |
Referências
- Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature? Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
- Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
