الكشف عن لوحة مخصصة MicroRNA المتداولة في المرضى الذين يعانون من سرطان القولون والمستقيم المنتشر
Summary
نقدم بروتوكولا لتقييم مستويات التعبير المتداولة ميكرورنا (ميرناس) في عينات البلازما من مرضى السرطان. على وجه الخصوص، قمنا باستخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً لتعميم استخراج ميرنا والنسخ العكسي. وأخيراً، قمنا بتحليل فريق من 24 ميرناس المحدد باستخدام مسبار مسبقاً رصدت في الوقت الحقيقي لوحات مخصصة.
Abstract
هناك اهتمام متزايد في خزعة سائلة لتشخيص مرض السرطان والتشخيص والرصد العلاجي، وخلق الحاجة إلى المؤشرات الحيوية موثوق بها ومفيدة للممارسة السريرية. نقدم هنا، بروتوكولا لاستخراج، عكس تدوين وتقييم مستويات التعبير المتداولة ميرناس من عينات البلازما للمرضى المصابين بسرطان القولون والمستقيم (CRC). ميكرورناس (ميرناس) هي فئة من الكشف غير الترميز من النيوكليوتيدات 18-25 في الطول التي تنظم التعبير عن الجينات المستهدفة على المستوى متعدية الجنسيات، وتلعب دوراً هاما، بما في ذلك وظيفة الأوعية الموالية والمناهضة، وفي الفيزيولوجيا المرضية الأجهزة المختلفة. ميرناس مستقرة في السوائل البيولوجية مثل المصل والبلازما، مما يجعلها مثالية تعميم المؤشرات الحيوية للسرطان في التشخيص والتشخيص والعلاج في عملية صنع القرار، والرصد. تعميم استخراج ميرنا أجرى باستخدام طريقة سريعة وفعالة تتضمن منهجيات العضوية ويستند إلى العمود. لميرنا ريتروترانسكريبتيون، استخدمنا إجراء متعدد خطوة التي تعتبر بوليادينيليشن في 3 ‘والربط للمحول في 5’ من ميرناس ناضجة، تليها ميرنا عشوائي قبل التضخيم. نحن تحديد 24-ميرنا لوحة مخصصة اختبار بالكمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (قرة-PCR) ورصدت تحقيقات ميرنا على لوحات مخصصة الصفيف. ونحن إجراء qRT PCR لوحة يعمل على نظام PCR الوقت الحقيقي. واختير ميرناس التدبير المنزلي لتطبيع استخدام البرمجيات جينورم (ف 3، 2). تم تحليل البيانات باستخدام التعبير جناح البرمجيات (v 1.1)، وأجريت التحليلات الإحصائية. الأسلوب ثبت أن تكون موثوقة وقوية من الناحية الفنية ويمكن أن تكون مفيدة لتقييم مستويات العلامات البيولوجية في العينات السائلة مثل البلازما أو المصل.
Introduction
تمثل اتفاقية حقوق الطفل الثالث الأكثر شيوعاً تشخيص الأورام الخبيثة والسبب الرابع للوفيات المتصلة بالسرطان في جميع أنحاء العالم. وحتى الآن، تمت الموافقة بيفاسيزوماب (ب)، وجسم [مونوكلونل] ضد عامل نمو الأوعية الدموية غشائي (VEGF)، وسيتوكسيماب (ج) أو بانيتوموماب (ع) من الأجسام المضادة الموجهة ضد مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR)، على العلاج الخط الأول بالاقتران مع نظم العلاج الكيميائي (CT).
الطفرات في الجينات رأس ك و رأس ن هي المؤشرات الحيوية مفيدة سريرياً فقط قادرة على تحديد المرضى الذين هم الأقل احتمالاً الاستفادة من قيراط المستندة إلى EGFR مكافحة على الرغم من أن عدة دراسات أجريت للبحث عن المؤشرات الحيوية التي تنبؤية للاستجابة ليقوم ب CT، لا يزال هناك نقص كبير في المخدرات فعالة وموثوقة لاستخدامها في الممارسة السريرية1.
ميرناس يتم الكشف الصغيرة (18-25 النيوكليوتيدات في الطول) التي تنظم ترجمة الجينات المستهدفة، وتلعب دوراً حاسما في العديد من عمليات فيسيوباثولوجيكال، بما في ذلك امبريوجينيسيس والتسرطن. هذه الجزيئات مستقرة جداً في السوائل بيولوجية مثل البلازما/مصل الدم والبول والبصاق، مما يجعلها قوية المؤشرات الحيوية لاستخدامها لأخذ العينات غير الغازية2. يمكننا استخدام لوحة للمشاركة في مسار الأوعية ميرناس، تهدف إلى تحديد جديد تعميم المؤشرات الحيوية قادرة على التنبؤ بالنتائج السريرية في المرضى مع اتفاقية حقوق الطفل المتنقل (بترول) تعامل مع نظام التصوير المقطعي المستندة إلى ب.
قمنا بتحليل مجموعة من 52 بترول المرضى الذين يعالجون على أساس ب CT داخل متعددة مستقبلية معشاة ذات شواهد المرحلة الثالثة للمحاكمة “الإيطالية للمحاكمة في متقدمة سرطان القولون والمستقيم” (ITACa). تمت الموافقة على هذا البروتوكول “اللجنة المحلية لأخلاقيات” (اللجنة Etico منطقة Vasta ه المعهد العلمية روماجنولو الواحد لو الاستوديو ه la Cura dei توموري (IRST) إيرككس، رقم 674) في 19عشر أيلول/سبتمبر 2007. وأعطى جميع المرضى المستنيرة قبل جمع عينة الدم. لكل مريض، جمعت عينات الدم الوريدي قبل العلاج وفي التقييم السريري الأول (بعد 8 أسابيع) لتقييم التعبير ميرنا الأساس والتحوير في أثناء فترة العلاج بالنسبة للمريض نتائج.
من خلال بحث الأدب، اخترنا ميرناس 21 يرتبط بعملية الأوعية التي هي معروفة لتكون قابلة للكشف في البلازما البشرية: ف له-مير-107، وقد-مير-126-3، ف قد-مير-145-5، ف قد-مير-194-5، قد-مير-199a-5 ف، قد مير-200b-3 ف، وقد-مير-20b-5 ف ، وقد-مير-21-5 ف، ف قد-مير-210-3، وف له-مير-221-3، ف قد-مير-24-3، ف قد مير-27 ألف-3 ف، قد-مير-29 باء-3 ف، قد-مير-335-5، ف قد-مير-424-5، ف قد-مير-497-5، ف قد مير-د 520-3 ف، قد-مير-92a-3 ف، قد-مير-17-5 وف له-مير-155-5. نحن أيضا بتحديد ف له-مير-223-3 وقد-مير-484 للتطبيع الذاتية3،،من45،6، وسل-مير-39 تنقيته من C. ايليجانس كمسمار في تطبيع خارجية. وأجريت جميع البيانات نورماليزيشنز باستخدام الأسلوب ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
ويعرض الكشف عن تعميم ميرناس بعض الصعوبات التقنية لأنه توجد الجزيئات عند مستويات منخفضة جداً في البلازما وعلى التضخيم كيميائيا صعبة نظراً لتسلسل قصيرة بها. لهذه الأسباب، نحن تحديد إجراء الذي يعتبر استخراج العضوية مع الفينول ومنهجية تستند إلى عمود ألياف زجاجية. تعميم استخراج ميرنا موضوع ساخن في ميدان خزعة سائلة، واخترنا مجموعة تجارية قد أظهرت أن تكون واحدة من الأكثر موثوقية من حيث كمية ونوعية غلة المستردة7،8. علينا تحديد بروتوكول لعكس نسخ ميرناس بإضافة محول في 5 ‘وذيل poly(A) إلى 3’ لميرنا ناضجة لتعزيز انتقائية وخصوصية من رد فعل.
نظراً لمتانة الأسلوب، ونحن تصميم لوحات مخصصة مع تحقيقات مسبقاً رصدت ل RT-PCR لتقييم كل عينة في التكرارات وحلل 2 المرضى داخل كل لوحة، كما هو مبين في الشكل 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
ميرناس صغيرة الكشف (18-25 النيوكليوتيدات في الطول) قادرة على ملزمة 3 ‘ UTR منطقة هدفهم رسول الجيش الملكي النيبالي وتثبيط و/أو المهينة غير الترميز. وبالتالي يمكن اعتبار المنظمين التعبير الجيني على المستوى متعدية الجنسيات. في العقد الماضي، وقد ارتبط ارتباطاً ميرناس عدة مع بدء السرطان والتنمية، ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذه الدراسة جزئيا s.p.a. روش ووكالة الأدوية الإيطالية (أيفا).
Materials
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
Referências
- Luo, H. -. Y., Xu, R. -. H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
- Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review. BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).
- Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR. FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).
- Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).
- Danese, E., et al. Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Zheng, G., et al. Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients. PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).
- Lv, W., et al. Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples. Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).
- Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs. Scientific reports. 5, 9430 (2015).
- Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration. PLoS medicine. 9 (5), (2012).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).
- Cheng, H. H., et al. Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels. PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).
- Moret, I., et al. Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction. PloS one. 8 (12), (2013).
- Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. Isolation of small noncoding RNAs from human serum). Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
