זיהוי של לוח מותאם אישית MicroRNA במחזור בחולים עם סרטן המעי הגס גרורתי
Summary
אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את רמת הביטוי של מחזורי microRNA (miRNAs) בדגימות הפלסמה של חולי סרטן. בפרט, השתמשנו ערכת זמינים מסחרית עבור מחזור miRNA החילוץ, שעתוק במהופך. לבסוף, ניתחנו את פאנל של 24 miRNAs שנבחר באמצעות לוחות מותאמים אישית בדיקה מראש הבחין בזמן אמת.
Abstract
שם היא הגדלת ההתעניינות ביופסיה נוזלי על אבחון סרטן, פרוגנוזה טיפולית ניטור, יוצרים את הצורך של סמנים ביולוגיים אמין ושימושי עבור הקלינית. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לחלץ, הפוכה לתמלל ולהעריך את רמות הביטוי של מחזורי miRNAs מ דגימות פלסמה של חולים עם סרטן המעי הגס (CRC). מיקרו Rna (miRNAs) הם סוג של אי קידוד RNAs של נוקלאוטידים 18-25 אורך לווסת את הביטוי של גנים היעד ברמת translational, לשחק תפקיד חשוב, כולל זו של הפונקציה pro – ו anti-אנגיוגנזה, physiopathology של איברים שונים. miRNAs יציבים ב נוזלים ביולוגיים כגון סרום, פלזמה, ההופכת אותם במחזור סמנים ביולוגיים לקבלת החלטות אבחון, פרוגנוזה וטיפול בסרטן וניטור אידיאלי. במחזור miRNA החילוץ בוצע באמצעות שיטה מהירה ויעילה הכרוכה האורגני והן מבוססי עמודה מתודולוגיות. עבור miRNA retrotranscription, השתמשנו תהליך רב שלבי ומתחשב פוליאדנילציה 3′ ו את מצדו של מתאם-5′ של miRNAs בוגרת, ואחריו miRNA אקראיים קדם הגברה. אנו נבחר לוח מותאם אישית 24-miRNA להיבדק ע י כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית), זיהה את הגששים miRNA על מערך לוחות מותאמים אישית. ביצענו לרביעיית-PCR צלחת פועל על מערכת ה-PCR בזמן אמת. משק miRNAs על נירמול נבחרו באמצעות תוכנת GeNorm (פס’ 3.2). הנתונים נותחו באמצעות ביטוי חבילת תוכנה (v 1.1), בוצעו ניתוחים סטטיסטיים. השיטה הוכיחה להיות אמין וחזק מבחינה טכנית, יכול להיות שימושי להעריך את רמות סמן דגימות נוזלים כגון פלזמה ו/או סרום.
Introduction
CRC מייצג השלישי מרבה אובחן גידול ממאיר, הגורם הרביעי של מוות מסרטן ברחבי העולם. עד כה, bevacizumab (B), נוגדן חד שבטי נגד כלי הדם-צמיחה אנדותל (VEGF), ו ארביטוקס (C) או וקטיביקס (P), נוגדנים חד-שבטיים נגד גורם הגדילה באפידרמיס קולטן (EGFR), אושרו על טיפול השורה הראשונה בשילוב עם משטרי כימותרפיה (CT).
מוטציות בגנים K-RAS ו- N-ראס הם סמנים שימושי קלינית היחיד המסוגל לזהות חולים נוטים פחות תועלת. לא אנטי-EGFR מבוססי למרות מספר מחקרים שנערכו כדי לחפש סמנים ביולוגיים שאינם חזוי של תגובה ל CT מבוסס-B, עדיין יש חוסר משמעותי של סמים יעיל ואמין לשימוש קליני1.
miRNAs הם קטנים RNAs (18-25 נוקלאוטידים אורך) להסדיר את התרגום של היעד גנים, לשחק תפקיד מכריע בתהליכי physiopathological רבים, כולל מופרה carcinogenesis. מולקולות אלה הן מאוד יציב נוזלים ביולוגיים כגון פלזמה/סרום, שתן, ברוק, ההופכת אותם סמנים ביולוגיים חזקים לשימוש עבור דגימה לא פולשנית2. באמצעות פאנל של miRNAs מעורב מסלול האנגיוגנזה, כיוונו כדי לזהות חדש במחזור סמנים ביולוגיים מסוגל לחזות תוצאה קליניים בחולים עם גרורות CRC (mCRC) מטופלים עם משטר CT מבוסס-B.
ניתחנו את סדרת 52 mCRC חולים שטופלו CT מבוסס-B בתוך multicenter פוטנציאליים אקראי שלב III למשפט “האיטלקי משפט ב מתקדמים סרטן המעי הגס” (ITACa). בפרוטוקול הנוכחי שאושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (Comitato e Etico באזור Vasta Istituto Scientifico Romagnolo לכל הלאו סטודיו e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 674 מס) על 19th בספטמבר 2007. כל המטופלים נתנה הסכמה מדעת לפני איסוף דגימת דם. עבור כל מטופל, דגימות דם ורידי שנאספו לפני הטיפול ועל ההערכה הקלינית הראשונה (אחרי 8 שבועות) כדי להעריך את הביטוי miRNA בסיסית וויסות שלה במהלך הטיפול ביחס לתוצאה המטופל.
דרך חיפוש של הספרות, בחרנו miRNAs 21 בקורלציה עם תהליך האנגיוגנזה, אשר ידועים להיות לזיהוי בפלסמה אנושית: p יש-מיר-107, יש-מיר-126-3, p יש-מיר-145-5, p יש-מיר-194-5, יש-מיר-199a – 5p, יש-מיר – 200 ב’ – 3p, יש-מיר – 20 ב’ – 5p , יש-מיר-21-5 p, יש-מיר-210-3 p, יש-מיר-221-3 p, יש-מיר-24-3 p, p יש-מיר-27האוויר – 3p, יש-מיר-29b – 3p, יש-מיר-335-5, p יש-מיר-424-5, p יש-מיר-497-5, p יש-מיר – 520d – 3p, יש-מיר-92a – 3p, יש-מיר-17-5 ו p יש-מיר-155-5. בחרנו גם יש-מיר-223-3 p וטיהרו יש-מיר-484 נורמליזציה אנדוגני3,4,5,6, צ’ל-מיר-39 מ- C. elegans ספייק-in עבור נרמול אקסוגני. כל הנתונים normalizations בוצעו באמצעות שיטת ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
הזיהוי של מחזורי miRNAs מציג קשיים טכניים כי המולקולות נמצאים ברמות נמוכות מאוד בפלסמה הגברה שלהם הוא מאתגר מבחינה כימית בהתחשב הרצף קצר שלהם. מסיבות אלה, בחרנו הליך זה מחשיב החילוץ אורגני עם פנול והן מתודולוגיה מבוססי עמודה סיבי זכוכית. במחזור miRNA החילוץ הוא נושא חם בתחום ביופסיה נוזלי, בחרנו ערכת מסחרי זה הראה לאחד ביותר מבחינת כמות ואיכות של התשואות התאושש7,8. בחרנו פרוטוקול להיפוך לתמלל miRNAs על ידי התוספת של מתאם 5′ ו זנב poly(A) כדי 3′ של miRNA בוגרת כדי לשפר את מידת הבררנות וספציפיות של התגובה.
בהתחשב החוסן של השיטה, אנו תוכנן לוחות מותאמים אישית עם קדם הבחינו זונדי RT-PCR להעריך כל דגימה של כפילויות, ניתח 2 חולים בתוך כל צלחת, כפי שמוצג באיור 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNAs קטנות ללא קידוד RNAs (18-25 נוקלאוטידים אורך) מסוגל מחייב 3′ UTR האזור של המטרה שלהם RNA שליח, עיכוב או זה משפיל. הם ובכך ניתן לראות הרגולטורים ביטוי גנים ברמת translational. בעשור האחרון, מספר miRNAs בקורלציה עם סרטן ייזום ופיתוח, גורם אותם סמנים קליניים שימושי לאבחון, פרוגנוזה וטיפול. מוגן על ידי RNases, miRNAs…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן באופן חלקי על ידי רוש S.p.A., סוכנות התרופות האיטלקית (דמרי).
Materials
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
Referências
- Luo, H. -. Y., Xu, R. -. H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
- Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review. BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).
- Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR. FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).
- Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).
- Danese, E., et al. Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Zheng, G., et al. Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients. PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).
- Lv, W., et al. Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples. Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).
- Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs. Scientific reports. 5, 9430 (2015).
- Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration. PLoS medicine. 9 (5), (2012).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).
- Cheng, H. H., et al. Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels. PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).
- Moret, I., et al. Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction. PloS one. 8 (12), (2013).
- Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. Isolation of small noncoding RNAs from human serum). Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
