Détection d’un Panel de micro-ARN Custom circulant chez les Patients atteints de Cancer Colorectal métastatique
Summary
Nous présentons un protocole pour évaluer les niveaux d’expression des microARN (miARN) en circulation dans les échantillons de plasma de patients atteints de cancer. En particulier, nous avons utilisé un kit disponible dans le commerce pour faire circuler l’extraction de miRNA et transcriptase inverse. Enfin, nous avons analysé un panel de 24 miARN sélectionnés à l’aide de plaques personnalisées sonde préalablement repéré en temps réel.
Abstract
Il est un intérêt croissant pour liquide biopsie pour le diagnostic du cancer, de pronostic et de suivi thérapeutique, créer le besoin pour des biomarqueurs fiables et utiles pour la pratique clinique. Nous présentons ici un protocole pour extraire, reverse transcrire et évaluer les niveaux d’expression des miARN provenant d’échantillons de plasma de patients atteints de cancer colorectal (CCR) en circulation. microARN (miARN) sont une classe d’ARN non codants des 18-25 nucléotides de long qui régulent l’expression de gènes cibles au niveau traductionnel et jouent un rôle important, y compris celle de la fonction pro – et anti-angiogéniques, dans la physiopathologie de différents organes. miARN est stables dans les fluides biologiques tels que le sérum et le plasma, ce qui les rend idéal circulant de biomarqueurs pour la prise de diagnostic, pronostic et le traitement du cancer et de surveillance. MiRNA extraction en circulation a été réalisée à l’aide d’une méthode rapide et efficace qui implique des méthodes organiques et basée sur les colonnes. MiRNA fut, nous avons utilisé une procédure multi-étapes qui considère la polyadénylation en 3′ et la ligature d’un adaptateur à 5′ de la miARN matures, suivie de pré-amplification miRNA aléatoire. Nous avons sélectionné un panneau personnalisé 24-miRNA à tester par quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) et repéré les sondes miRNA sur plaques personnalisées de tableau. Nous avons effectué qRT-PCR plaque fonctionne sur un système de PCR en temps réel. MiARN de ménage pour la normalisation ont été sélectionnés à l’aide du logiciel GeNorm (version 3.2). Données ont été analysées à l’aide du logiciel de la suite Expression (v 1.1) et les analyses statistiques ont été réalisées. La méthode s’est avérée fiable et techniquement solide et pourrait être utile pour évaluer les niveaux de biomarqueurs dans les échantillons liquides tels que le plasma ou le sérum.
Introduction
CRC représente la troisième plus fréquemment diagnostiqué une tumeur maligne et la quatrième cause de décès liés au cancer dans le monde. A ce jour, (B) le bevacizumab, un anticorps monoclonal dirigé contre le facteur de croissance vasculaire endothéliale (VEGF) et (C) le cetuximab ou panitumumab (P), des anticorps monoclonaux dirigés contre le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), ont été approuvées pour traitement de première ligne en combinaison avec la chimiothérapie (CT).
Mutations dans les gènes de K-RAS et N-RAS sont les seuls biomarqueurs cliniquement utiles capables d’identifier les patients qui sont moins susceptibles de bénéficier de CT base anti-EGFR. Bien que plusieurs études ont été menées pour rechercher les biomarqueurs qui sont prédictifs de réponse au CT axée sur la B, il y a toujours un manque considérable de médicaments fiables et efficaces pour une utilisation en pratique clinique1.
miARN est de petits ARN (18-25 nucléotides de long) qui réglementent la traduction des gènes cibles et joue un rôle essentiel dans de nombreux processus physiopathologiques, y compris l’embryogenèse et cancérogenèse. Ces molécules sont très stables dans les liquides biologiques comme le plasma/sérum, urine et crachats, ce qui les rend robustes biomarqueurs à utiliser pour l’échantillonnage non invasif2. Utilisant un panel des miARN impliqués dans la voie angiogénique, notre objectif était d’identifier les nouvelles circulant biomarqueurs capables de prédire l’issue clinique chez les patients atteints de cancer Colorectal métastatique (mCRC) traités par un traitement à base de B CT.
Nous avons analysé une série de 52 mCRC patients traités par CT B-basée dans la prospective multicentrique randomisée de phase III du procès « italien du procès dans Advanced Cancer Colorectal » (ITACa). Le présent protocole a été approuvé par le Comité d’éthique Local (Comitato Etico zone Vasta e Scientifico Romagnolo Istituto per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, n° 674) sur 19th septembre 2007. Tous les patients ont donné le consentement éclairé avant le prélèvement d’échantillons de sang. Pour chaque patient, les échantillons de sang veineux ont été recueillies avant traitement et à la première évaluation clinique (après 8 semaines) pour évaluer le niveau de référence miRNA expression et sa modulation pendant le traitement par rapport aux résultats pour les patients.
Grâce à une recherche de la littérature, nous avons sélectionné des 21 miARN en corrélation avec le processus angiogénique qui sont connus pour être détectable dans le plasma humain : a-miR-107, a-miR-126-3 p. p a-miR-145-5, a-miR-194-5, a-miR-199 – 5P, a-miR – 200 b – 3P, a-miR – 20 b – 5p , a-miR-21-5 p, a-miR-210-3 p, p a-miR-221-3, a-miR-24-3 p, p a-miR – 27 a – 3 p. a-miR – 29 b – 3, a-miR-335-5, p a-miR-424-5, a-miR-497-5 p, p a-miR – 520d – 3 p. a-miR – 92 a – 3, a-miR-17-5 et a-miR-155-5 p. Nous avons également sélectionné p a-miR-223-3 et a-mir-484 pour normalisation endogène3,4,5,6et cel-miR-39 épuré de c. elegans comme spike-in pour la normalisation exogène. Tous les normalisations de données ont été réalisées à l’aide de la méthode de ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
La détection des miARN en circulation présente quelques difficultés techniques car les molécules sont présents en très faibles quantités dans le plasma et leur amplification est chimiquement difficile compte tenu de leur courte séquence. Pour ces raisons, nous avons choisi une procédure qui tient compte tant organique d’extraction avec le phénol et une méthodologie basée sur les colonnes de fibre de verre. MiRNA extraction en circulation est un sujet d’actualité dans le domaine des liquide biopsie, et nous avons choisi une trousse commerciale qui a montré l’un des plus fiables en termes de quantité et qualité des rendements récupéré7,8. Nous avons sélectionné un protocole pour inverser transcrire des miARN par l’ajout d’un adaptateur à 5′ et une queue poly (a) à 3′ de la miRNA mature pour améliorer la sélectivité et la spécificité de la réaction.
Étant donné la robustesse de la méthode, nous avons conçu des plaques personnalisées avec des sondes pré tachetés de RT-PCR évaluer chaque échantillon en double exemplaire et analysé 2 patients dans chaque assiette, comme illustré à la Figure 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
miARN est petit RNAs (18-25 nucléotides de long) qui lie la région 3′ UTR de leurs cibles ARN messager et inhibant et/ou dégradant il non codantes. Ils peuvent donc être considérés régulateurs d’expression de gène au niveau traductionnel. Au cours de la dernière décennie, plusieurs miARN ont été corrélés avec le déclenchement du cancer et le développement, ce qui les rend utiles biomarqueurs cliniques pour le diagnostic, le pronostic et la thérapie. Protégés par des ribonucléases, miARN est présent…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été partiellement financée par Roche S.p.A. et l’agence italienne du médicament (AIFA).
Materials
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
Referências
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