Microscopie 4D de levure
Summary
Ce protocole décrit l’analyse des compartiments intracellulaires étiquetés fluorescents dans la levure en herbe utilisant la microscopie confocale 4D multicolore (time-lapse 3D). Les paramètres d’imagerie sont choisis pour capturer des signaux adéquats tout en limitant les dégâts photo. Les plugins Custom ImageJ permettent de suivre et d’analyser quantitativement les structures étiquetées.
Abstract
L’objectif de ce protocole est de caractériser la façon dont les compartiments membranaires se forment et se transforment en cellules vivantes de levure en herbe. Beaucoup de compartiments intracellulaires dans la levure sont dynamiques, et une compréhension complète de leurs propriétés exige l’imagerie de time-lapse. La microscopie multicolore de fluorescence confocale 4D est une méthode puissante pour suivre le comportement et la composition d’un compartiment intracellulaire sur une échelle de temps de 5-15 min. L’analyse rigoureuse de la dynamique des compartiments nécessite la capture de milliers d’optiques Sections. Pour atteindre cet objectif, le blanchiment photo et la phototoxicité sont réduits au minimum en scannant rapidement à très faible puissance laser, et les dimensions de pixel et les intervalles Z-step sont réglés aux plus grandes valeurs qui sont compatibles avec l’échantillonnage de l’image à pleine résolution. Les ensembles de données 4D qui en résultent sont bruyants mais peuvent être lissés par la déconvolution. Même avec des données de haute qualité, la phase d’analyse est difficile parce que les structures intracellulaires sont souvent nombreuses, hétérogènes et mobiles. Pour répondre à ce besoin, des plugins ImageJ personnalisés ont été écrits pour mettre en réseau des données 4D sur un écran d’ordinateur, identifier les structures d’intérêt, modifier les données pour isoler les structures individuelles, quantifier les cours de temps de fluorescence et faire des films des piles Z projetées. Les films 4D sont particulièrement utiles pour distinguer les compartiments stables des compartiments transitoires qui se retournent par maturation. De tels films peuvent également être utilisés pour caractériser des événements tels que la fusion de compartiments, et pour tester les effets de mutations spécifiques ou d’autres perturbations.
Introduction
Les compartiments du système endomembrane sont en constante évolution, et leur caractérisation complète nécessite une imagerie cellulaire vivante. Décrit ici est un protocole qui emploie la microscopie confocale 4D (time-lapse 3D) pour visualiser les compartiments fluorescents étiquetés dans les levures en herbe. La méthode a été développée pour suivre la dynamique des compartiments sécréteurs dans Pichia pastoris et Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Ce protocole se concentre sur S. cerevisiae, qui a un Golgi non empilé dans lequel les cisternae individuelles sont optiquement résolvables4. L’organisation inhabituelle de Golgi dans S. cerevisiae a permis la démonstration par microscopie 4D qu’une cisterna de Golgi étiquette d’abord avec les protéines tôt résidentes de Golgi, et perd alors ces protéines tout en acquérant les protéines golgi tardives résidantes3 ,5. Cette transition peut être visualisée en créant une souche dans laquelle la protéine Golgi Vrg4 est étiquetée avec gFP tandis que la protéine Golgi tardive Sec7 est étiquetée avec une protéine fluorescente rouge monomeric. Lorsque les cisternae individuelles sont suivies, la maturation est observée comme une conversion vert-rouge3. Ce type d’analyse peut fournir des informations précieuses sur la localisation des protéines et l’identité du compartiment. Par exemple, deux protéines avec des heures d’arrivée et de départ légèrement décalées peuvent parfois sembler étiqueter différents compartiments dans des images statiques, mais peuvent être vues dans des films 4D pour étiqueter le même compartiment à différents points de temps6,7 . Ainsi, la microscopie 4D révèle des phénomènes qui ne seraient pas évidents autrement.
La microscopie 4D informative des compartiments à levures peut être réalisée avec des procédures et un équipement appropriés2. Dans la mesure du possible, le marquage des protéines fluorescentes est effectué par remplacement génétique8 pour éviter les artefacts surexpression. Parce que les structures intracellulaires sont souvent très dynamiques, la formation image 4D est nécessaire pour s’assurer qu’une structure est suivie de façon fiable au fil du temps. Le protocole décrit ici utilise un microscope confocal à balayage laser équipé de détecteurs de haute sensibilité. Avec cet appareil, le volume cellulaire entier de S. cerevisiae peut être imagepar microscopie confocale approximativement tous les 1-3 s, avec 2 intervalles de s étant typiques. Les données peuvent être recueillies jusqu’à 5-15 min en fonction des densités d’étiquetage des fluorophores et de leurs propriétés photophysiques. Le principal obstacle est de minimiser le photoblanchiment. À cette fin, les intensités laser sont maintenues aussi bas que possible, la vitesse de balayage confocal e est maximisée, et les paramètres optiques sont configurés pour l’image à la limite Nyquist afin de capturer les informations pertinentes tout en évitant l’exposition excessive à la lumière. Ces paramètres sont également censés soulager la phototoxicité, un facteur qui est souvent négligé lors de l’imagerie cellulaire en direct9,10,11. Les données bruyantes qui en résultent sont traitées avec des algorithmes de correction de l’eau de Javel et de déconvolution pour faciliter la quantification des intensités de fluorescence.
Même avec des films 4D de haute qualité, l’analyse est délicate parce que les compartiments à levures ont tendance à être nombreux, hétérogènes et mobiles. En raison des limites intrinsèques de la microscopie confocale et des réglages non optimaux requis pour une imagerie 4D prolongée, les structures fluorescentes qui sont proches les unes des autres sont difficiles à résoudre. Ce problème peut être contourné en se concentrant sur le petit nombre de structures fluorescentes qui restent optiquement résolvables pendant toute la durée de la période d’étiquetage, en supposant que ces structures sont représentatives de l’ensemble de la population d’étiquettes Compartiments. Les compartiments fluorescents qui peuvent être suivis de façon fiable sont identifiés en visionnant des films de piles Z projetées et en créant une série de montages dans lesquels les sections optiques pour chaque point de temps sont disposées sur un écran d’ordinateur. Cette analyse utilise des plugins ImageJ12 personnalisés, qui permettent de suivre une structure individuelle de manière isolée.
Des méthodes récentes ont couvert l’utilisation de protéines fluorescentes dans la levure13 ainsi que la théorie et la pratique de l’imagerie confocale 4D des cellules de levure2. Ce protocole se concentre sur les principaux aspects pratiques d’une expérience d’imagerie 4D. Il comprend quelques améliorations aux procédures précédemment décrites, ainsi que des versions mises à jour du code plugin ImageJ et de la documentation. L’exemple montré se concentre sur la dynamique Golgi, mais ce protocole est tout aussi approprié pour l’imagerie d’autres compartiments à levures.
Protocol
Representative Results
Discussion
La formation image confocale 4D des organites de levure exige l’adage soigneux des paramètres multiples. La principale préoccupation est le blanchiment et la phototoxicité. Un film 4D typique consiste à collecter des milliers de sections optiques, de sorte que l’éclairage laser doit être maintenu aussi bas que possible. Les étiquettes de protéines fluorescentes Tandem peuvent être utilisées pour stimuler le signal sans augmenter l’expression de la protéine étiquetée16,<sup …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention des NIH R01 GM104010. Merci pour l’aide à la microscopie de fluorescence à Vytas Bindokas et Christine Labno à l’installation de base de microscopie intégrée, qui est soutenu par le Nih-financé Cancer Center Support Grant P30 CA014599.
Materials
| 35 mm glass bottom dishes No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | Imaging dishes |
| Concanavalin A powder | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Huygens Essential software, version 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolution software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software |
Referências
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