4D mikroskopi av jäst

Summary

Detta protokoll beskriver analysen av fluorescerande märkta intracellulära fack i spirande jäst med flera färger 4D (Time-lapse 3D) konfokal mikroskopi. Avbildnings parametrarna väljs för att fånga upp lämpliga signaler samtidigt som foto skador begränsas. Custom ImageJ plugins tillåta märkta strukturer spåras och kvantitativt analyseras.

Abstract

Målet med detta protokoll är att karakterisera hur membran avdelningar bildas och förvandlas i levande celler av spirande jäst. Många intracellulära fack i jäst är dynamiska, och en fullständig förståelse av deras egenskaper kräver tidsförlopp Imaging. Multi-Color 4D konfokal fluorescens mikroskopi är en kraftfull metod för att spåra beteendet och sammansättningen av ett intracellulärt fack på en tidsskala på 5-15 min. noggrann analys av utrymmets dynamik kräver avskiljning av tusentals optiska Sektioner. För att uppnå detta mål minimeras foto blekning och fototoxicitet genom att snabbt scanna med mycket låg lasereffekt, och pixeldimensionerna och Z-stegintervallen är inställda på de största värden som är kompatibla med sampling av bilden med full upplösning. De resulterande 4D datauppsättningarna är bullriga men kan utjämnas genom deconvolution. Även med hög kvalitet data, är analysfasen utmanande eftersom intracellulära strukturer är ofta många, heterogena, och mobila. För att tillgodose detta behov, anpassade ImageJ plugins skrevs till array 4D data på en datorskärm, identifiera strukturer av intresse, redigera data för att isolera enskilda strukturer, kvantifiera fluorescens tid kurser, och göra filmer av de projicerade Z-stackar. 4D-filmer är särskilt användbara för att särskilja stabila fack från övergående kupéer som förvandlas till mognad. Sådana filmer kan också användas för att karakterisera händelser som kupé fusion, och för att testa effekterna av specifika mutationer eller andra perturbations.

Introduction

Fack i endomembrane systemet är i konstant Flux, och deras fulla karakterisering kräver levande cell avbildning. Beskrivs här är ett protokoll som sysselsätter 4D (Time-lapse 3D) konfokal mikroskopi att visualisera överföras märkta fack i spirande jäst. Metoden utvecklades för att spåra dynamiken i sekretoriska fack i Pichia pastoris och Saccharomyces cerevisiae^1,2,3. Detta protokoll fokuserar på S. Cerevisiae, som har en nonstacked Golgi där enskilda cisternae är optiskt matchas⁴. Den ovanliga Golgi organisation i S. cerevisiae möjliggjort demonstration av 4D mikroskopi att en Golgi Cisterna initialt etiketter med hemvist tidigt Golgi proteiner, och sedan förlorar dessa proteiner samtidigt förvärva bosatt sent Golgi proteiner^{3 ,5}. Denna övergång kan visualiseras genom att skapa en stam där den tidiga Golgi proteinet Vrg4 är märkt med GFP medan den sena Golgi protein Sec7 är märkt med en monomera rött fluorescerande protein. När enskilda cisternae spåras, mognad observeras som en grön-till-röd omvandling³. Denna typ av analys kan ge värdefull information om protein lokalisering och kupé identitet. Till exempel kan två proteiner med något offset ankomst-och avgångstider ibland visas för att märka olika fack i statiska bilder, men kan ses i 4D-filmer för att märka samma fack vid olika tidpunkter^6,7 . Således avslöjar 4D mikroskopi fenomen som annars inte skulle vara uppenbara.

Informativ 4D mikroskopi av jäst fack kan uppnås med lämpliga förfaranden och utrustning². När det är möjligt, fluorescerande protein märkning utförs av Gene Replacement⁸ för att undvika överuttryck artefakter. Eftersom intracellulära strukturer är ofta mycket dynamiska, 4D Imaging behövs för att säkerställa att en struktur spåras tillförlitligt över tiden. Det protokoll som beskrivs här sysselsätter en laserskanning konfokal Mikroskop utrustad med hög känslighet detektorer. Med denna enhet, hela cell volymen av S. cerevisiae kan avbildas av konfokal mikroskopi ungefär varje 1-3 s, med 2 S intervall är typiska. Data kan samlas in för upp till 5-15 min beroende på märkningen tätheter av fluoroforer och deras foto fysikaliska egenskaper. Det huvudsakliga hindret är att minimera photoblekning. För detta ändamål är laser intensiteterna hålls så låg som möjligt, den konfokala skanningshastigheten är maximerad, och de optiska parametrarna är konfigurerade för att bilden på Nyquist gränsen för att fånga relevant information och samtidigt undvika överdriven ljus exponering. Dessa inställningar förväntas också lindra fototoxicitet, en faktor som ofta förbises under levande cell avbildning^9,10,11. Den resulterande bullriga data bearbetas med blekmedel korrigering och deconvolution algoritmer för att underlätta kvantifiering av fluorescens intensiteter.

Även med hög kvalitet 4D filmer, är analysen knepigt eftersom jästen fack tenderar att vara många, heterogena, och mobila. På grund av de inneboende begränsningarna av konfokalmikroskopi och de icke-optimala inställningar som krävs för långvarig 4D-avbildning, är fluorescerande strukturer som är nära varandra svåra att lösa. Detta problem kan kringgås genom att fokusera på det lilla antalet fluorescerande strukturer som förblir optiskt matchas under märknings perioden, med antagandet att dessa strukturer är representativa för hela populationen av märkta Fack. Fluorescerande fack som kan spåras på ett tillförlitligt sätt identifieras genom att visa filmer av projicerade Z-stackar och genom att skapa en serie montage där de optiska avsnitten för varje tidspunkt är klädd på en datorskärm. Denna analys sysselsätter anpassade ImageJ¹² plugins, som tillåter en individuell struktur som ska spåras i isolering.

Nya metoder Papers omfattade användning av fluorescerande proteiner i jäst¹³ samt teori och praktik av 4D konfokala avbildning av jästceller². Detta protokoll fokuserar på de viktigaste praktiska aspekterna av en 4D Imaging experiment. Den innehåller vissa förbättringar av tidigare beskrivna procedurer, samt uppdaterade versioner av ImageJ plugin-koden och dokumentation. Det exempel som visas fokuserar på Golgi dynamik, men detta protokoll är lika lämplig för avbildning andra jästfack.

Protocol

1. förberedelser Gör icke fluorescerande minimal NSD medium2. Avsaknaden av riboflavin förväntas minska bakgrunden intracellulär grön fluorescens och tillhörande fototoxicitet. Odla jäststammen över natten vid ~ 23 ° c till logaritmisk fas i 5 mL NSD i en 50 mL förbryllad kolv med god luftning. Om 3-4 h före analys, späd jästkulturen i färskt NSD så att den slutliga OD600 kommer att vara 0,5-0,8 vid tidpunkten för avbildning. Bered en 2 mg/mL lösning a…

Representative Results

Det exempel som ges här dokument och kvantifierar mogningen av två jäst Golgi cisternae som visualiseras av Dual-Color 4D konfokalmikroskopi3. En jästcell innehåller på order av 10-15 Golgi cisternae, som alla mognar under en tidsperiod på cirka 2-4 min. mognad kan visualiseras genom att tagga den tidiga Golgi markör Vrg4 med GFP och genom att tagga den sena Golgi markören Sec7 med en röd fluorescerande protein som mCherry eller mScarlet. En individ Ciste…

Discussion

4D konfokal avbildning av jäst organeller kräver noggrann trimning av flera parametrar. Det stora problemet är foto blekning och fototoxicitet. En typisk 4D-film innebär att samla tusentals optiska sektioner, så laser belysningen måste hållas så låg som möjligt. Tandem fluorescerande proteintaggar kan användas för att öka signalen utan att öka uttrycket av det taggade proteinet^16,17. Maximera skanningshastigheten hjälper till att begränsa photodam…

Materials

35 mm glass bottom dishes No. 1.5	MatTek	P35G-0.170-14-C	Imaging dishes
Concanavalin A powder	Sigma-Aldrich	C2010
Trolox	Vector Laboratories	CB-1000
Leica SP8 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite X	Leica Microsystems		Microscope software
Huygens Essential software, version 17.04	Scientific Volume Imaging		Deconvolution software
ImageJ	NIH		Image processing and analysis software