4D-mikroskopi af gær

Summary

Denne protokol beskriver analysen af fluorescently mærkede intracellulære rum i spirende gær ved hjælp af multi-Color 4D (time-lapse 3D) confokal mikroskopi. Billedbehandlings parametrene vælges til at opfange passende signaler, samtidig med at foto skader begrænses. Brugerdefinerede ImageJ plugins tillader, at mærkede strukturer spores og analyseres kvantitativt.

Abstract

Målet med denne protokol er at karakterisere, hvordan membran rum form og omdanne i levende celler af spirende gær. Mange intracellulære rum i gær er dynamiske, og en fuld forståelse af deres egenskaber kræver tidsforskudt billeddannelse. Multi-Color 4D confokal Fluorescens mikroskopi er en kraftfuld metode til at spore opførsel og sammensætning af et intracellulært rum på en tidsskala på 5-15 min. grundig analyse af rummets dynamik kræver opsamling af tusindvis af optiske Sektioner. For at nå dette mål minimeres foto blegning og fototoksicitet ved at scanne hurtigt ved meget lav laser effekt, og pixeldimensionerne og Z-trins intervallerne er indstillet til de største værdier, der er kompatible med prøvetagning af billedet ved fuld opløsning. De resulterende 4D datasæt er støjende, men kan udjævnet ved dekoncentrering. Selv med data af høj kvalitet er analysefasen udfordrende, fordi intracellulære strukturer ofte er talrige, heterogene og mobile. For at imødekomme dette behov, Custom ImageJ plugins blev skrevet til array 4D data på en computerskærm, identificere strukturer af interesse, redigere data for at isolere individuelle strukturer, kvantificere fluorescens tid kurser, og gøre film af de projekterede Z-stakke. 4D-film er især nyttige til at skelne stabile rum fra forbigående rum, der vender sig over ved modning. Sådanne film kan også bruges til at karakterisere begivenheder såsom rum fusion, og til at teste virkningerne af specifikke mutationer eller andre forstyrrelser.

Introduction

Rum i endomembrane systemet er i konstant flux, og deres fulde karakterisering kræver levende celle scanning. Beskrevet her er en protokol, der beskæftiger 4D (time-lapse 3D) Konfokal mikroskopi til at visualisere fluorescently mærkede rum i spirende gær. Metoden blev udviklet til at spore dynamikken i sekretoriske rum i Pichia pastoris og Saccharomyces cerevisiae^1,2,3. Denne protokol fokuserer på S. cerevisiae, som har en ikke-stablet Golgi, hvor de enkelte cisternae er optisk opløselige⁴. Den usædvanlige Golgi-organisation i S. cerevisiae gjorde det muligt at demonstrere ved 4d-mikroskopi, at en Golgi Cisterna oprindeligt mærker med residente tidlige Golgi-proteiner, og derefter mister disse proteiner, mens de erhverver residente sene Golgi-proteiner^{3 ,5}. Denne overgang kan visualiseres ved at skabe en stamme, hvor den tidlige Golgi protein Vrg4 er mærket med GFP, mens den sene Golgi protein Sec7 er mærket med et monomerisk rødt fluorescerende protein. Når individuelle cisternae spores, observeres modning som en grøn-til-rød konvertering³. Denne type analyse kan give værdifulde oplysninger om protein lokalisering og rum identitet. For eksempel kan to proteiner med let forskudt ankomst og afgangstider undertiden synes at mærke forskellige rum i statiske billeder, men kan ses i 4d-film for at mærke det samme rum på forskellige tidspunkter^6,7 . Således, 4D mikroskopi afslører fænomener, der ellers ikke ville være indlysende.

Informativ 4D-mikroskopi af gærrum kan opnås med passende procedurer og udstyr². Når det er muligt, udføres fluorescerende protein mærkning ved genudskiftning⁸ for at undgå overekspressions artefakter. Da intracellulære strukturer ofte er meget dynamiske, er 4D-billeddannelse nødvendig for at sikre, at en struktur spores pålideligt over tid. Den protokol, der er beskrevet her, beskæftiger en Laserscanning Konfokal mikroskop udstyret med høj følsomhed detektorer. Med denne enhed, kan hele celle volumen af S. cerevisiae være afbildet af confokal mikroskopi ca hver 1-3 S, med 2 S intervaller er typiske. Data kan indsamles for op til 5-15 min afhængigt af mærkningen tætheder af fluorophores og deres photophysical egenskaber. Hoved forhindring er at minimere foto blegning. Til dette formål, laser intensiteter holdes så lavt som muligt, den confokale scanningshastigheden er maksimeret, og de optiske parametre er konfigureret til billede på Nyquist grænse for at fange de relevante oplysninger og samtidig undgå overdreven lys eksponering. Disse indstillinger forventes også at lindre fototoksicitet, en faktor, der ofte overses under levende celle billeddannelse^9,10,11. De resulterende støjende data behandles med blege korrektion og dekoncentrationsalgoritmer for at lette kvantificering af fluorescens intensiteter.

Selv med høj kvalitet 4D-film, analysen er vanskelig, fordi gærrum tendens til at være talrige, heterogene, og mobile. På grund af de iboende begrænsninger af confokal mikroskopi og de ikke-optimale indstillinger, der kræves til langvarig 4D-billeddannelse, er fluorescerende strukturer, der er tæt på hinanden, svære at løse. Dette problem kan omgås ved at fokusere på det lille antal fluorescerende strukturer, der forbliver optisk afvikles i varigheden af mærknings perioden, med den antagelse, at disse strukturer er repræsentative for hele populationen af mærket Rum. Fluorescerende rum, der kan spores pålideligt, identificeres ved at se film af projekterede Z-stakke og ved at oprette en serie af montager, hvor de optiske sektioner for hvert tidspunkt er opstillet på en computerskærm. Denne analyse anvender brugerdefinerede ImageJ¹² plugins, som gør det muligt at spore en individuel struktur isoleret.

Nylige metoder papirer dækkede brugen af fluorescerende proteiner i gær¹³ samt teori og praksis 4d konfokale Imaging af gærceller². Denne protokol fokuserer på de vigtigste praktiske aspekter af et 4D-billedbehandlings eksperiment. Den indeholder nogle forbedringer af tidligere beskrevne procedurer samt opdaterede versioner af ImageJ plugin Code og dokumentation. Det viste eksempel fokuserer på Golgi dynamik, men denne protokol er lige så velegnet til billeddannelse andre gærrum.

Protocol

1. forberedelse Lav ikke fluorescerende minimal NSD medium2. Fraværet af riboflavin forventes at reducere baggrunds intracellulær grøn fluorescens og tilhørende fototoksicitet. Dyrke gærstammen natten over ved ~ 23 °C til logaritmisk fase i 5 mL NSD i en 50 mL forvirret kolbe med god beluftning. Omkring 3-4 h før analyse, fortynde gærkulturen i frisk NSD, således at den endelige OD600 vil være 0,5-0,8 på tidspunktet for billeddannelse. Forbered en 2 mg/mL opl…

Representative Results

Eksemplet her dokumenter og kvantificerer modning af to gær Golgi cisternae som visualiseret af Dual-Color 4D confokal mikroskopi3. En gærcelle indeholder på rækkefølgen af 10-15 Golgi cisternae, som hver modnes over et tidsforløb på ca. 2-4 min. modning kan visualiseres ved at tagge den tidlige Golgi-markør Vrg4 med GFP og ved at tagge den sene Golgi-markør Sec7 med et rødt fluorescerende protein såsom mCherry eller mScarlet. En individuel Cisterna etik…

Discussion

4d konfokale Imaging af gær organeller kræver omhyggelig tuning af flere parametre. Den største bekymring er foto blegning og fototoksicitet. En typisk 4D-film involverer indsamling af tusindvis af optiske sektioner, så laser belysningen skal holdes så lav som muligt. Tandem fluorescerende protein Tags kan bruges til at øge signalet uden at øge ekspression af det mærkede protein^16,17. Maksimering af scanningshastigheden hjælper med at begrænse foto skad…

Materials

35 mm glass bottom dishes No. 1.5	MatTek	P35G-0.170-14-C	Imaging dishes
Concanavalin A powder	Sigma-Aldrich	C2010
Trolox	Vector Laboratories	CB-1000
Leica SP8 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite X	Leica Microsystems		Microscope software
Huygens Essential software, version 17.04	Scientific Volume Imaging		Deconvolution software
ImageJ	NIH		Image processing and analysis software