Meting van de energie-stofwisseling in transplanteren retinale weefsel met behulp van extracellulaire Flux-analyse
Summary
Deze techniek wordt beschreven real-time opname van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven in het netvlies weefsel transplanteren muis met behulp van een extracellulaire flux-analyzer.
Abstract
Hoge gezichtsscherpte visie is een zwaar energieverbruikende proces, en het netvlies heeft verscheidene unieke aanpassingen precies om dergelijke eisen met behoud van de transparantie van de visuele as ontwikkeld. Verstoringen op dit delicate evenwicht veroorzaken verblindende ziekten, zoals diabetische retinopathie. Het begrip van energie metabolisme veranderingen in het netvlies tijdens ziekte is dus noodzakelijk om de ontwikkeling van rationele therapieën voor verschillende oorzaken van vison verlies. De recente komst van verkrijgbare extracellulaire flux analyzers heeft de studie van retinale energiemetabolisme toegankelijker gemaakt. Dit protocol beschrijft het gebruik van dergelijke een analysator voor het meten van bijdragen aan het netvlies energievoorziening door haar twee beginsel wapens – oxidatieve fosforylatie en glycolyse – door het kwantificeren van de veranderingen in het zuurstof verbruik (OCR) en extracellulaire verzuring tarieven (ECAR) als proxy’s voor deze trajecten. Deze techniek wordt gemakkelijk uitgevoerd in transplanteren retinale weefsel, vergemakkelijking van de beoordeling van reacties op meerdere farmacologische agenten in een enkele experiment. Metabole handtekeningen in het netvlies van de dieren ontbreekt staaf fotoreceptor signalering worden vergeleken met wild-type besturingselementen met behulp van deze methode. Een belangrijke beperking bij deze techniek is het gebrek aan vermogen om te discrimineren tussen licht aangepast en dark-adapted energie gebruik, een belangrijke fysiologische overweging in netvlies weefsel.
Introduction
Het netvlies is een van de meest energie-eisen weefsels in het centrale zenuwstelsel1. Zoals de meeste weefsels genereert het adenosine trifosfaat (ATP) via glycolyse in het cytosol of via oxidatieve fosforylatie in de mitochondriën. De energieke voordeel van oxidatieve fosforylatie over glycolyse te produceren van ATP van één molecuul glucose is duidelijk: 36 moleculen van ATP gegenereerd op basis van de voormalige vs. 2 moleculen van ATP gegenereerd op basis van de laatste. Dienovereenkomstig, retinale neuronen is voornamelijk afhankelijk van mitochondriale ademhaling voor energievoorziening en dit komt tot uiting door hun hoge dichtheid van mitochondriën2. Nog, het netvlies ook sterk afhankelijk van glycolytic machines zelfs wanneer zuurstof overvloedig is. Dit proces van aërobe glycolyse werd oorspronkelijk in kankercellen beschreven door Otto Warburg3, die eens merkte op dat het netvlies het alleen na mitotische weefsel staat van deze vorm van metabolisme4. Sinds deze eerste opmerkingen, zijn veel post mitotische weefsels beschreven om deel te nemen in verschillende graden van glycolyse naast oxidatieve fosforylatie om hun ATP-eisen te voldoen.
Phototransduction, visuele pigment recycling, biosynthese van fotoreceptor buitenste segmenten, en synaptische activiteit zijn alle energie veeleisende processen in de researchdieren, de overheersende neuronale subklasse in het netvlies. Maar de noodzaak om actief transport van ionen tegen hun elektrische gevaren en concentratie verlopen is veruit het meest energiek tijdrovend proces in neuronen1. Researchdieren zijn eigenaardige neuronen in de zin dat ze zijn depolarized bij gebrek aan stimulatie (dat wil zeggen, in het donker), overwegende dat een lichte stimulans kanaal sluiting en latere hyperpolarisatie activeert. Daarom, in het donker verbruikt het netvlies grote hoeveelheden van ATP of te handhaven de depolarisatie “donkere huidig” zoals het gewoonlijk genoemd wordt. Vanuit een adaptieve oogpunt is een belangrijke uitdaging bij het verstrekken van deze enorme hoeveelheden van ATP de noodzaak van organismen om visuele helderheid door de optische as. De omgekeerde retinale architectuur gezien in moderne wezens is de dominante oplossing, zoals het houdt de dichte capillaire netwerk leveren researchdieren uit de buurt van het pad van licht. Maar dit wonder van natuurlijke bioengineering plaatst het netvlies in een afgrond in termen van metabole reserve. Zelfs kleine beledigingen aan netvlies kunnen potentieel verstoren het delicate evenwicht van de energievoorziening te eisen, en visuele disfunctie of openhartige blindheid kan ontstaan snel.
Gezien de unieke energetische eisen van het neurale netvlies, in combinatie met haar strakke beperking vasculaire voorzieningszekerheid, zou kunnen nauwkeurige meting van ATP verbruik in het netvlies en de veranderingen tijdens ziekte verstrekkende gevolgen in begrijpen en behandelen hebben verblindende aandoeningen zoals retinitis pigmentosa en diabetische retinopathie. Traditioneel, vereisen deze metingen dure, douane-ontworpen apparatuur met de meeste studies die voortkomen uit een handvol laboratoria geheel gewijd aan de metingen van de metabole activiteit2,5,6, 7,8. Technieken omvatten individuele tests voor specifieke metabolieten, tracer studies met radio-geëtiketteerden precursoren, zuurstofverbruik opname via Clark elektroden, en profilering van de9metabolomic.
Met high-throughput technologische vooruitgang en toegenomen beschikbaarheid van commerciële apparaten zijn technieken voor record retinale stofwisseling steeds toegankelijk en betaalbaar. De hier beschreven methode meet beide oxidatieve fosforylatie en transplanteren glycolyse bij het gebruik van het netvlies weefsel en een verkrijgbare extracellulaire flux analyzer9,10,11,12. Deze analyzer registreert afzonderlijk zuurstof verbruik rente (OCR) en de extracellulaire verzuring (ECAR), fungeren als indirecte indicatoren van oxidatieve fosforylatie en glycolyse, respectievelijk13. Deze metingen zijn gedaan door een sonde onderdompelen in een microchamber gemaakt over het weefsel van belang. Deze aanpassing van eerder gepubliceerde methoden gebruikt een plaat van de vangst oorspronkelijk ontworpen voor alvleesklier eilandjes van Langerhans voor het vastleggen van de metabole activiteit in kleine, cirkelvormige secties van muis netvlies. Meerdere farmacologische belichtingen kunnen worden afgeleverd bij het weefsel in de loop van een enkele opname, omdat het systeem 4 injectie-poorten voor elk monster goed bevat. Met behulp van dit systeem met afzonderlijke protocollen geoptimaliseerd voor ECAR- en OCR-opnamen, de reacties van het netvlies van de wild-type kunnen worden vergeleken met netvlies ontbreekt transducine (Gnat1– / –), een oorzaak van aangeboren stationaire nacht blindheid in mensen14.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCR en ECAR worden gemakkelijk gemeten in transplanteren retinale weefsel met behulp van een bioanalyzer met behulp van de beschreven technieken. Deze methode vertrekt van die van andere groepen in verschillende kritische stappen. Netvlies weefsels zijn geïsoleerd door middel van een grote cornea incision zonder enucleating van de hele wereld, zoals oorspronkelijk beschreven door Winkler15. Deze methode van retinale isolatie zorgt voor een snelle overdracht van het oog van de levende in de weefse…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Alexander Kolesnikov en Dr. Vladimir Kefalov voor het verstrekken van Gnat1– / –muizen, voor nuttige feedback en advies en voor het lezen van het manuscript.
Dit werk werd gesteund door NIH EY025269 (RR), het onderzoekscentrum van de Diabetes aan de Washington University – NIH DK020579 (JRM en RR), een carrière ontwikkeling Award van onderzoek te voorkomen blindheid (RR), de Horncrest Foundation (RR), een carrière ontwikkeling Award van JDRF () JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) en DK114233 (JRM).
Materials
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps – Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals | |
Referências
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
- Ames, A., Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Wubben, T. J., et al. Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration. Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).
- Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers. Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).
- Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging. Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).
- Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
- Winkler, B. S. Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function. The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).
- Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Pearsall, E. A., et al. PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival. BMC biology. 15 (1), 113 (2017).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of visualized experiments. (46), (2010).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Winkler, B. S. The electroretinogram of the isolated rat retina. Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).
- Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Du, J., et al. Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina. The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).
