Extracellular फ्लक्स विश्लेषण का उपयोग Explanted रेटिना ऊतक में ऊर्जा चयापचय का मापन
Summary
इस तकनीक का वर्णन वास्तविक समय ऑक्सीजन की खपत और एक extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग explanted माउस रेटिना ऊतकों में extracellular अंलीकरण दरों की रिकॉर्डिंग ।
Abstract
उच्च तीक्ष्णता दृष्टि एक भारी ऊर्जा लेने वाली प्रक्रिया है, और रेटिना कई अद्वितीय रूपांतरों के लिए ठीक ऐसी मांगों को पूरा करते हुए दृश्य धुरी की पारदर्शिता बनाए रखने विकसित की है । इस नाजुक संतुलन के लिए Perturbations, जैसे मधुमेह रेटिनोपैथी के रूप में अंधा कर रही बीमारियों । इसलिए, रोग के दौरान रेटिना में ऊर्जा चयापचय परिवर्तन की समझ vison हानि के विभिन्न कारणों के लिए तर्कसंगत चिकित्सा के विकास के लिए आवश्यक है. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध extracellular फ्लक्स विश्लेषक के हाल के आगमन रेटिना ऊर्जा चयापचय का अध्ययन अधिक सुलभ बना दिया है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन इस तरह के एक विश्लेषक के उपयोग के लिए अपने दो सिद्धांत हथियारों के माध्यम से रेटिना ऊर्जा की आपूर्ति के लिए योगदान उपाय-ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण और glycolysis-ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) और extracellular में परिवर्तन को बढ़ाता है अंलीकरण दरों (ीकार) के रूप में इन रास्ते के लिए परदे के बाहर । इस तकनीक को आसानी से explanted रेटिना ऊतक में किया जाता है, एक ही प्रयोग में कई औषधीय एजेंटों के लिए प्रतिक्रियाओं का आकलन की सुविधा । जानवरों से रेटिना में चयापचय हस्ताक्षर की कमी रॉड photoreceptor संकेतन जंगली प्रकार इस पद्धति का उपयोग कर नियंत्रण की तुलना में कर रहे हैं. इस तकनीक में एक प्रमुख सीमा के बीच भेदभाव करने की क्षमता की कमी है प्रकाश अनुकूलित और अंधेरे अनुकूलित ऊर्जा उपयोग, रेटिना ऊतक में एक महत्वपूर्ण शारीरिक विचार ।
Introduction
रेटिना केंद्रीय तंत्रिका तंत्र1में सबसे अधिक ऊर्जा की मांग ऊतकों के बीच है । सबसे ऊतकों की तरह, यह cytosol में glycolysis के माध्यम से या ऑक्सीडेटिव में फास्फारिलीकरण mitochondria के माध्यम से adenosine ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) उत्पंन करता है । glycolysis से अधिक ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के ऊर्जावान लाभ ग्लूकोज का एक अणु से एटीपी का उत्पादन करने के लिए स्पष्ट है: एटीपी के ३६ अणुओं पूर्व बनाम 2 के बाद से उत्पंन के अणुओं से उत्पंन । तदनुसार, रेटिना ंयूरॉंस मुख्य रूप से ऊर्जा की आपूर्ति के लिए mitochondrial श्वसन पर निर्भर है और यह उनके2mitochondria के उच्च घनत्व से परिलक्षित होता है । हालांकि, रेटिना भी ऑक्सीजन प्रचुर मात्रा में है जब भी glycolytic मशीनरी पर भारी निर्भर करता है । एरोबिक glycolysis की यह प्रक्रिया मूल ओटो Warburg द्वारा कैंसर की कोशिकाओं में वर्णित किया गया था3, जो एक बार ध्यान दिया है कि रेटिना केवल पोस्ट mitotic चयापचय4के इस रूप में सक्षम ऊतक था । उन प्रारंभिक टिप्पणियों के बाद से, कई पोस्ट mitotic ऊतकों को ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के अलावा glycolysis की डिग्री अलग में संलग्न करने के लिए अपने एटीपी मांगों को पूरा करने के लिए वर्णित किया गया है ।
Phototransduction, दृश्य वर्णक रीसाइक्लिंग, photoreceptor बाहरी क्षेत्रों का संश्लेषण, और synaptic गतिविधि photoreceptors में सभी ऊर्जा की मांग प्रक्रियाओं, रेटिना में प्रमुख ंयूरॉन उपवर्ग हैं । लेकिन सक्रिय रूप से उनके बिजली और एकाग्रता ढाल के खिलाफ आयनों परिवहन की जरूरत है द्वारा अब तक सबसे अधिक ऊर्जावान लेने वाली प्रक्रिया ंयूरॉंस में1। Photoreceptors अर्थ में अजीब ंयूरॉंस रहे है कि वे उत्तेजना के अभाव में विनाशक है (यानी, अंधेरे में), जबकि एक प्रकाश उत्तेजना चैनल बंद करने और बाद में hyperpolarization से चलाता है । इसलिए, अंधेरे में, रेटिना एटीपी की बड़ी मात्रा में अपने ध्रुवीकरण या “डार्क वर्तमान” के रूप में इसे आमतौर पर कहा जाता है बनाए रखने के लिए भस्म हो जाती है । एक अनुकूली दृष्टिकोण से, एटीपी के इन विशाल मात्रा की आपूर्ति में एक प्रमुख चुनौती जीवों के लिए की जरूरत है ऑप्टिकल धुरी के माध्यम से दृश्य स्पष्टता बनाए रखने के लिए है । यह घने केशिका नेटवर्क प्रकाश के पथ से दूर photoreceptors की आपूर्ति रहता है के रूप में, आधुनिक प्राणियों में देखा उल्टे रेटिना वास्तुकला प्रमुख समाधान है । लेकिन प्राकृतिक इंजीनियरिंग के इस चमत्कार चयापचय आरक्षित के मामले में एक करारा में रेटिना स्थानों । रेटिना के लिए भी छोटे अपमान संभावित मांग करने के लिए ऊर्जा की आपूर्ति के नाजुक संतुलन को बाधित कर सकते हैं, और दृश्य रोग या फ्रैंक अंधापन जल्दी से पीछा करना पड़ सकता है ।
तंत्रिका रेटिना की अनूठी ऊर्जावान मांगों को देखते हुए, संवहनी आपूर्ति के अपने तंग प्रतिबंध के साथ युग्मित, रेटिना में एटीपी खपत की सटीक माप और रोग के दौरान अपने परिवर्तन समझ और इलाज में गहरा प्रभाव हो सकता है कंकरीट की स्थितियां जैसे रेटनाइटिस pigmentosa और डायबिटिक रेटिनोपैथी । परंपरागत रूप से, इन माप महंगा, कस्टम-सबसे प्रयोगशालाओं की एक मुट्ठी भर से उभरती हुई अध्ययन के साथ उपकरण तैयार पूरी तरह से चयापचय गतिविधि की माप के लिए समर्पित2,5,6, 7,8. तकनीक विशिष्ट चयापचयों के लिए व्यक्तिगत परख शामिल हैं, अनुरेखक रेडियो का उपयोग अध्ययन-लेबल वाले पुरोगामी, ऑक्सीजन की खपत क्लार्क इलेक्ट्रोड का उपयोग रिकॉर्डिंग, और metabolomic9profiling.
उच्च प्रवाह प्रौद्योगिकी और वाणिज्यिक उपकरणों की वृद्धि की उपलब्धता में प्रगति के साथ, रेटिना चयापचय रिकॉर्ड करने के लिए तकनीक तेजी से सुलभ और सस्ती कर रहे हैं. विधि यहां वर्णित दोनों ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण और glycolysis रेटिना में explanted ऊतक और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध extracellular फ्लक्स विश्लेषक9,10,11,12का उपयोग करने के उपाय । इस विश्लेषक अलग ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) और extracellular अंलीकरण दर (ीकार), ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण और glycolysis, क्रमशः13के अप्रत्यक्ष संकेतकों के रूप में सेवारत रिकॉर्ड । ये माप एक microchamber के भीतर एक जांच submersed द्वारा किया जाता है ब्याज की ऊतक पर बनाया । पहले से प्रकाशित तरीकों का यह अनुकूलन एक कब्जा प्लेट मूलतः आइलेट्स के अग्नाशय के टाप के लिए डिजाइन करने के लिए छोटे, माउस रेटिना के परिपत्र वर्गों में चयापचय गतिविधि रिकॉर्ड का उपयोग करता है । कई औषधीय जोखिम ऊतक के लिए एक एकल रिकॉर्डिंग के दौरान वितरित किया जा सकता है क्योंकि प्रणाली में प्रत्येक नमूने के लिए अच्छी तरह से 4 इंजेक्शन बंदरगाहों शामिल हैं । ीकार और ओसीआर रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूलित अलग प्रोटोकॉल के साथ इस प्रणाली का उपयोग करना, जंगली प्रकार के रेटिना की प्रतिक्रियाओं transducin कमी रेटिना की तुलना में किया जा सकता है (Gnat1-/-), जन्मजात स्थिर रात अंधापन का एक कारण मनुष्य१४.
Protocol
Representative Results
Discussion
ओसीआर और ीकार आसानी से explanted रेटिना में मापा जाता है तकनीक का उपयोग कर एक प्रतिविश्लेषक का उपयोग कर । इस विधि के कई महत्वपूर्ण चरणों में अंय समूहों के उन से प्रस्थान । रेटिना के ऊतकों ग्लोब enucleating बिना एक बड?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ अलेक्जेंडर Kolesnikov और डॉ व्लादिमीर Kefalov Gnat1 प्रदान करने के लिए धंयवाद-/चूहों, उपयोगी प्रतिक्रिया और सलाह के लिए, और पांडुलिपि पढ़ने के लिए ।
यह काम NIH EY025269 (आरआर), वाशिंगटन विश्वविद्यालय में मधुमेह अनुसंधान केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था-NIH DK020579 (JRM और आरआर), अंधापन को रोकने के लिए अनुसंधान से एक कैरियर विकास पुरस्कार (आरआर), Horncrest फाउंडेशन (आरआर), JDRF से एक कैरियर विकास पुरस्कार ( JRM), NIH DK101392 (सीएफएस), DK020579 (सीएफएस), DK056341 (सीएफएस), और DK114233 (JRM) ।
Materials
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps – Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals | |
Referências
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