Измерение энергии метаболизма в описаны ткани сетчатки, с помощью анализа внеклеточного Flux
Summary
Этот метод описывает записи в реальном времени потребления кислорода и внеклеточной подкисления ставок описаны мыши сетчатки тканей с использованием анализатора внеклеточного потока.
Abstract
Высокая острота зрения представляет собой процесс сильно потребления энергии, и сетчатки разработал несколько уникальных адаптации точно выполнять такие требования при сохранении прозрачности зрительной оси. Возмущений в этот деликатный баланс вызывают ослепительный болезней, таких как диабетическая ретинопатия. Таким образом понимание энергии метаболизма изменения в сетчатке во время болезни необходимо для разработки рациональной терапии для различных причин утраты vison. Недавнее появление коммерчески доступных внеклеточного потока анализаторы сделал исследование сетчатки энергии метаболизма более доступными. Этот протокол описывает использование такого анализатора измерить вклад сетчатки энергоснабжение через два принципа оружие – окислительного фосфорилирования и гликолиза – путем количественной оценки изменений в уровнях потребления кислорода (OCR) и внеклеточной показатели подкисления (ECAR) как прокси для этих путей. Этот метод легко выполняется в описаны ткани сетчатки, облегчения оценки ответов на несколько фармакологических агентов в одном эксперименте. Метаболические подписей в сетчатки от животных, не хватает стержень фоторецепторных сигнализации по сравнению с одичал тип элементов управления, с помощью этого метода. Одним из основных ограничений в этой технике является отсутствие способности различать использования света адаптированных и dark-adapted энергии, важным физиологическим в ткани сетчатки.
Introduction
Сетчатка является одним самых требовательных энергии тканей в центральной нервной системе1. Как и большинство тканей он генерирует аденозинтрифосфатом (АТФ) через гликолиз в цитозоль или через окислительного фосфорилирования в митохондриях. Энергичный преимущество Оксидативное фосфорилирование гликолиз производить АТФ из одной молекулы глюкозы ясна: 36 молекулы АТФ генерируется из бывших против 2 молекулы АТФ, созданный из последнего. Соответственно нейроны сетчатки главным образом зависят от митохондриальное дыхание для поставок энергии и это отражено в их высокой плотности митохондрий2. Тем не менее сетчатки также полагается на гликолитических машин даже тогда, когда кислород обильные. Этот процесс аэробного гликолиза первоначально был описан в раковых клетках Отто Варбург3, который однажды отметил, что только после митотическая ткани, способную метаболизма4сетчатки. После этих первоначальных наблюдениях участвовать в той или иной степени гликолиза в дополнение к окислительное фосфорилирование к их требованиям СПС были описаны многие пост митотическая тканей.
Phototransduction, визуальные пигмент рециркуляции, биосинтез наружной сегментов фоторецепторных и синаптической активности являются все энергии требовательных процессов в фоторецепторных клеток, преобладающим нейрональных подкласс в сетчатке. Но на сегодняшний день наиболее энергетически длительный процесс в нейроны1является необходимость активно транспорт ионов против их электрические и градиенты концентрации. Фоторецепторы являются своеобразным нейронов в том смысле, что они являются деполяризованный в отсутствие стимуляции (т.е., в темноте), тогда как легкие стимул вызывает закрытие канала и последующих гиперполяризации. Таким образом в темноте, сетчатки потребляет большое количество АТФ для поддержания ее деполяризации или «Темновой ток», как это обычно называют. С точки зрения адаптации одной из основных проблем в обеспечении этих огромное количество АТФ является необходимость организмов поддерживать четкость через оптической оси. Перевернутый сетчатки архитектура, видели в современном существ является доминирующим решение, как он держит плотной капиллярной сети, поставку фоторецепторы от пути света. Но это чудо природных биоинженерии сетчатки на краю пропасти с точки зрения метаболических резерва. Даже небольшие оскорбления к сетчатке потенциально может нарушить хрупкий баланс поставок энергии для спроса, и визуальный дисфункции или откровенный слепота может наступить быстро.
Учитывая уникальный энергичный требования нейронных сетчатки, в сочетании с ее жесткие ограничения кровоснабжения, точное измерение потребления АТП в сетчатке и его изменения во время болезни может иметь серьезные последствия в понимании и лечении ослепительный условия, такие как пигментный ретинит и диабетической ретинопатии. Традиционно эти измерения требуют дорогостоящей, специально оборудования с большинства исследований, выходящих из несколько лабораторий, полностью посвященный измерений метаболической активности2,5,6, 7,8. Методы включают в себя отдельные анализы для конкретных метаболитов, трассирующими исследования с использованием радио меченых прекурсоров, потребление кислорода, запись с помощью электродов Кларк и Метаболомные профилирования9.
С достижениями в технологии высокой пропускной способности и повышение доступности коммерческих устройств методы для записи обмена веществ сетчатки являются более доступными и дешевыми. Метод, описанный здесь меры как окислительного фосфорилирования и гликолиза в сетчатке с помощью описаны ткани и коммерчески доступные внеклеточного потока анализатор9,10,11,12. Этот анализатор отдельно записи скорости потребления кислорода (OCR) и уровень внеклеточного подкисления (ECAR), выступающей в качестве косвенных показателей окислительного фосфорилирования и гликолиз, соответственно13. Эти измерения выполняются зонд submersed в пределах microchamber, поверх ткани интерес. Эта адаптация ранее опубликованных методов использует захвата плита, первоначально разработанный для островков Лангерганса поджелудочной железы для записи метаболической активности в небольших, циркуляр разделы мыши сетчатки. Несколько фармакологического воздействия может быть доставлен ткани в течение одной записи, потому что система содержит 4 инъекции портов для каждого образца хорошо. С помощью этой системы с отдельными протоколами, оптимизированный для записи ECAR и OCR, ответы сетчатки одичал типа можно сравнить с сетчатки не хватает transducin (Gnat1– / –), причиной врожденной стационарных ночной слепоты в люди14.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCR и ECAR легко измеряются в описаны ткани сетчатки, с помощью bioanalyzer, с помощью описанных методов. Этот метод отличается от других групп в нескольких важных шагов. Сетчатки тканей изолированы через большой разрез роговицы без enucleating всему миру, как первоначально описанных Карлом Уинклер<su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Александр Колесников и д-р Владимир Kefalov за предоставление Gnat1– / –мышей, за полезные отзывы и советы и для чтения рукопись.
Эта работа была поддержана, низ EY025269 (ОР), исследовательский центр университета Вашингтона – низ DK020579 диабет (JRM и RR), премии развития карьеры от исследований по предотвращению слепоты (ОР), Фонд Horncrest (ОР), премии развития карьеры с JDRF ( JRM), низ DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) и DK114233 (JRM).
Materials
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps – Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals | |
Referências
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
- Ames, A., Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Wubben, T. J., et al. Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration. Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).
- Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers. Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).
- Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging. Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).
- Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
- Winkler, B. S. Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function. The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).
- Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Pearsall, E. A., et al. PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival. BMC biology. 15 (1), 113 (2017).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of visualized experiments. (46), (2010).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Winkler, B. S. The electroretinogram of the isolated rat retina. Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).
- Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Du, J., et al. Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina. The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).
