Misurazione del metabolismo energetico in tessuto retinico Explanted usando l'analisi di flusso extracellulare
Summary
Questa tecnica viene descritto la registrazione in tempo reale del consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare nei tessuti retinici explanted del mouse utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare.
Abstract
Alta acuità visione è un processo fortemente che consumano energia, e la retina ha sviluppato diversi adattamenti unici per soddisfare proprio queste esigenze pur mantenendo la trasparenza dell’asse visivo. Perturbazioni di questo delicato equilibrio causano malattie accecante, quali la retinopatia diabetica. Di conseguenza, la comprensione dei cambiamenti di metabolismo energetico nella retina durante la malattia è indispensabile per lo sviluppo di terapie razionali per varie cause di perdita di vison. Il recente avvento di analizzatori di flusso extracellulare commercialmente disponibile ha reso più accessibile lo studio del metabolismo energetico della retina. Questo protocollo descrive l’uso di un tal analizzatore per misurare contributi all’approvvigionamento energetico della retina attraverso le braccia due principio – fosforilazione ossidativa e la glicolisi – quantificando le variazioni dei tassi di consumo di ossigeno (OCR) ed extracellulari tariffe di acidificazione (ECAR) come proxy per queste vie. Questa tecnica viene eseguita prontamente in tessuto retinico explanted, facilitando la valutazione delle risposte agli agenti farmacologici multipli in un singolo esperimento. Metaboliche firme in retine da animali carenti asta del fotoricettore segnalazione sono confrontate ai comandi di selvaggio-tipo utilizzando questo metodo. Una limitazione importante in questa tecnica è la mancanza di capacità di discriminare tra l’utilizzazione di energia luce-adattato e scuro-adattato, una considerazione importante fisiologica in tessuto retinico.
Introduction
La retina è tra i tessuti più esigente di energia nel sistema nervoso centrale1. Come la maggior parte dei tessuti, che genera l’adenosina trifosfato (ATP) tramite la glicolisi nel citosol o tramite fosforilazione ossidativa nei mitocondri. La convenienza energetica di fosforilazione ossidativa sopra glicolisi per produrre ATP da una molecola di glucosio è chiara: 36 molecole di ATP generato dal ex vs 2 molecole di ATP generata da quest’ultimo. Di conseguenza, neuroni retinici dipendono principalmente dalla respirazione mitocondriale per l’approvvigionamento energetico e questo si riflette dalla loro alta densità di mitocondri2. Ancora, la retina anche dipende fortemente dalle macchine glicolitica anche quando l’ossigeno è abbondante. Questo processo di glicolisi aerobica è stata originariamente descritta in cellule tumorali di Otto Warburg3, che una volta ha notato che la retina era il solo post-mitotico tessuto capace di questa forma di metabolismo4. Da tali osservazioni iniziali, molti tessuti post-mitotici sono stati descritti per impegnarsi in vari gradi di glicolisi oltre alla fosforilazione ossidativa per soddisfare le loro richieste di ATP.
Fototrasduzione, pigmento visivo, riciclaggio, biosintesi di segmenti esterni del fotoricettore ed attività sinaptica sono tutti i processi di energia esigente nei fotorecettori, la sottoclasse predominante di un neurone nella retina. Ma la necessità di trasportare attivamente gli ioni contro loro elettrico e gradienti di concentrazione è di gran lunga il processo più energico che richiede in neuroni1. Fotorecettori sono neuroni peculiari nel senso che essi sono depolarizzate in assenza di stimolazione (cioè, al buio), considerando che uno stimolo luminoso innesca la chiusura del canale e successive hyperpolarization. Di conseguenza, al buio, la retina consuma grandi quantità di ATP per mantenere sua depolarizzazione o “corrente di buio”, come viene comunemente chiamato. Dal punto di vista adattativo, una sfida importante nella fornitura di queste vaste quantità di ATP è la necessità di organismi mantenere la chiarezza visiva attraverso l’asse ottico. L’architettura retinica invertito visto in creature moderni è la soluzione dominante, come mantiene la fitta rete capillare fornitura fotorecettori lontano dal percorso della luce. Ma questa meraviglia di Bioingegneria naturale mette la retina a un precipizio in termini di riserva metabolica. Anche i piccoli insulti alla retina potenzialmente possono compromettere il delicato equilibrio di energia offerta alla domanda, e la disfunzione visiva o cecità frank può seguire rapidamente.
Date le richieste energetiche uniche della retina neurale, accoppiato con la sua limitazione stretto di rifornimento vascolare, misura accurata del consumo di ATP in retina e i suoi cambiamenti durante la malattia potrebbe avere profonde implicazioni nella comprensione e nel trattamento condizioni accecante come retinite pigmentosa e retinopatia diabetica. Tradizionalmente, queste misure richiedono attrezzature costose, personalizzati con maggior parte degli studi emergenti da una manciata di laboratori interamente dedicati alle misure di attività metabolica2,5,6, 7,8. Le tecniche includono singoli saggi per specifici metaboliti, gli studi di tracciante usando radio-marcato precursori, consumo di ossigeno registrazione utilizzando elettrodi di Clark e metabolomica profilatura9.
Con gli avanzamenti nella tecnologia ad alta velocità e una maggiore disponibilità di dispositivi commerciali, tecniche per registrare metabolismo retinico sono sempre più accessibile e conveniente. Il metodo qui descritto misura entrambi fosforilazione ossidativa e la glicolisi in retina utilizzando espiantati tessuto e un flusso extracellulare reperibile analizzatore9,10,11,12. Questo analizzatore registra separatamente tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR), che servono come indicatori indiretti di fosforilazione ossidativa e la glicolisi, rispettivamente13. Queste misure sono fatte da una sonda immersa all’interno di un microchamber creato sopra il tessuto di interesse. Questo adattamento dei metodi precedentemente pubblicati utilizza una piastra di acquisizione originariamente progettata per gli isolotti di Langerhans per registrare l’attività metabolica in piccole, circolare sezioni della retina di topo. Esposizioni multiple farmacologiche possono essere consegnate al tessuto nel corso di una singola registrazione perché il sistema contiene ben 4 porte di iniezione per ogni campione. Utilizzando questo sistema con distinti protocolli ottimizzati per registrazioni ECAR e OCR, le risposte delle retine di selvaggio-tipo possono essere paragonate a retine carente transducina (Gnat1– / –), delle cause di cecità notturna congenita stazionaria in gli esseri umani14.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCR ed ECAR prontamente sono misurati in tessuto retinico explanted utilizzando un bioanalyzer utilizzando le tecniche descritte. Questo metodo parte da quelle degli altri gruppi in diversi passaggi critici. Tessuto retinico è isolati attraverso una grande incisione cornea senza enucleando il globo, come originariamente descritto da Winkler15. Questo metodo di isolamento retinica consente un rapido trasferimento dall’occhio vivente nella piastra di cattura del tessuto (spesso entro 5 minuti). Tes…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Alexander Kolesnikov e Dr. Vladimir Kefalov per fornire Gnat1– / –topi, per utili feedback e consigli e per la lettura il manoscritto.
Questo lavoro è stato supportato da NIH EY025269 (RR), il centro di ricerca del diabete presso la Washington University – NIH DK020579 (JRM e RR), il Career Development Award dalla ricerca per prevenire la cecità (RR), la Fondazione di Horncrest (RR), il Career Development Award dal JDRF ( JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) e DK114233 (JRM).
Materials
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps – Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals | |
Referências
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