Funktionel overflade-immobilisering af gener ved hjælp af omstændelig Strand forskydning litografi
Summary
Vi beskriver en simpel Litografisk metode for immobilisering af gen-længde DNA molekyler på en overflade, som kan bruges til at udføre celle-fri gen expression eksperimenter på biochips.
Abstract
Immobilisering af gener på lithographically strukturerede overflader giver studiet af opdelte gen expression processer i en åben mikrofluid bioreaktor system. I modsætning til andre tilgange til kunstige cellulære systemer, sådan en opsætning giver mulighed for en konstant forsyning med gen expression reagenser og samtidige dræning af affaldsprodukter. Dette letter gennemførelsen af celle-fri gen expression processer over længere perioder, hvilket er vigtigt for realiseringen af dynamiske gen regulerende feedbacksystemer. Her giver vi en detaljeret protokol for fabrikation af genetiske biochips ved hjælp af en simpel at bruge Litografisk teknik baseret på DNA streng forskydning reaktioner, som udelukkende bruger kommercielt tilgængelige komponenter. Vi giver også en protokol om integration af opdelte gener med en Polydimethylsiloxan (PDMS)-baseret mikrofluid system. Vi viser desuden, at systemet er kompatibelt med total interne reflection fluorescens (JOHANNAS) mikroskopi, som kan bruges til direkte observation af molekylære interaktioner mellem DNA og molekyler, der indgår i blandingen, udtryk.
Introduction
Celle-gratis genekspression reaktioner er af stor interesse for forskellige anvendelser i biokemi, bioteknologiske og syntetisk biologi. Celle-fri udtryk for proteiner var medvirkende til fremstilling af ren protein prøver, som blev grundlaget for talrige undersøgelser i strukturbiologi. For eksempel, blev celle-fri systemer med succes brugt til udtryk for protein komplekser1 eller membran proteiner2, som er vanskelige at producere ved hjælp af celle-baseret udtryk. Navnlig, celle-fri genekspression reaktioner blev også brugt til at belyse strukturen af den genetiske kode, begyndende med de banebrydende eksperimenter af Nirenberg og Matthaei i 19613.
For nylig har der været en fornyet interesse i celle-gratis metoder inden for bioteknologi og syntetisk biologi4,5,6. Celle-fri systemer kan være forøget med ikke-biologiske forbindelser, og komponenter af forskellige biologiske oprindelse kan kombineres flere uden sammenligning7. Selv om celle-fri systemer har den tilsyneladende ulempe, at de ikke “vokse og dele”, er det tænkeligt at forberede åben celle-fri bioreaktorer med grundlæggende metaboliske funktioner og lad dem syntetisere metabolitter når forsynet med enkel kulstof og energi indgange8. Inden for det nye syntetiske biologi lover celle-fri systemer at være en mere forudsigelig “kabinet” for gennemførelsen af syntetiske biologiske funktioner.
I øjeblikket, celle-fri gen expression reaktioner foretages enten ved hjælp af celle ekstrakter (fra forskellige kilder såsom bakterier, gær, insekter), eller omskrivning/oversættelse systemer, som var optimeret til forskellige applikationer (f.eks. prokaryote vs eukaryotisk genekspression, produktion af membranproteiner, osv.). En populær protokol til forberedelse af bakteriel celle ekstrakt (almindeligvis kaldt TXTL) blev leveret for nylig af V. Noireaux og kolleger9. Dens biofysiske egenskaber har været grundigt karakteriseret10, og TXTL systemet har været allerede anvendt med succes til at udføre en række komplekse biokemiske opgaver: fx samling af funktionelle Bakteriofager via celle-fri udtryk for phage genom11, syntesen af bakteriel protein filamenter12eller gennemførelsen af celle-fri gen kredsløb13,14.
Et andet system populære i celle-fri syntetisk biologi er den rene system, som er fremstillet af renset komponenter15,16. I forhold til TXTL systemet, indeholder det ikke nukleaser eller protein nedbrydning maskiner. Mens nedbrydning af lineære DNA er RNA molekyler eller proteiner mindre af et problem i den rene system, henfald veje er faktisk vigtigt for gennemførelsen af dynamiske funktioner. For at reducere effekten af exonuclease nedbrydning af lineære gen skabeloner i TXTL systemet (gennem RecBCD), har beskyttelse af slutningen GamS protein at blive tilføjede. Både TXTL og den rene system er kommercielt tilgængelige.
Et emne beslægtet nært med celle-fri biologi bekymringer undersøgelse af effekten af opdelingen på biokemiske reaktioner, og yderligere at skabe kunstige celle-lignende strukturer eller protocells17,18,,19 ,20. Forskning på kunstige celler involverer typisk indkapsling af en biokemisk reaktion system indersiden af vesikulære segmenter fremstillet af fosfolipider eller andre amphiphiles. Mens sådanne systemer hjælpe med at udforske fundamentale aspekter af opdelingen eller fremkomsten af celleforandringer og selvkopierende strukturer, de står over for de typiske problemer af lukkede systemer: i mangel af en fungerende stofskifte og passende membran transportmekanismer, det er svært at holde opdelte reaktioner kørende i længere tid – brændstof molekyler er brugt op og affaldsstoffer akkumulere.
Et interessant alternativ til opdelingen i sådan celle-efterligne rum er den rumlige organisering af genetisk materiale ved hjælp af photolithographic metoder. Immobilisering af “gener på en chip” var banebrydende ved Bar-Ziv-gruppen på Weizmann-instituttet for mere end ti år siden21. Blandt de store spørgsmål, der skulle løses var uspecifikke adsorption af DNA og den potentielle denaturering af proteiner på chip overflade. Bar-Ziv et al. udviklet en dedikeret fotolitografi modstå betegnes “Daisy”, som var sammensat af en reaktiv terminal silan for immobilisering af modstå molekyler på siliciumdioxid overflader, en lang polyethylenglycol (PEG) spacer, der forsikrede biokompatibilitet, og en photocleavable headgroup, som blev omdannet til en reaktiv Amin ved bestråling med ultraviolet (UV) lys. Det har vist sig at Daisy kan bruges til at immobilisere gen-længde DNA molekyler (med længder af flere kilo-basepar (kbp)) på en chip overflade. Fra en polymer fysik synspunkt repræsenteret systemerne polymer pensler podet på et fast underlag. På grund af DNA polyelectrolyte karakter er kropsbygning af disse pensler stærkt påvirket af osmotisk og andre ion-specifikke effekter22,23.
Vigtigst af alt, har det vist sig at substrat-immobiliseret gener er stadig funktionel og kan være transskriberede og oversættes til RNA og protein. Gen pensler er tilgængelige for RNA polymeraser fra løsning24, og den komplekse makromolekylære blanding af omskrivning/oversættelse er ikke denatureret på overfladen. En af fordelene ved immobilisering af genetiske komponenter på et substrat er, at de kan betjenes i en åben mikrofluid reaktor system, der løbende leveres med små forløber molekyler og fra hvilke affaldsprodukter kan være fjernet25 , 26.
Vi har for nylig udviklet en variant af denne metode kaldes Bephore (for biokompatible elektronstråle og photoresist)27, som var baseret udelukkende på kommercielt tilgængelige komponenter og udnyttet sekvens-specifikke DNA streng invasion reaktioner for realiseringen af en enkel at implementere omstændelig litografi procedure til oprettelse af chip-baserede kunstige celler. En skematisk oversigt over proceduren er vist i figur 1. Det er baseret på DNA hårnål molekyler, der indeholder en photocleavable gruppe, der er immobiliseret på et biokompatibelt PIND lag. Photocleavage af hårnålen udsætter en enkeltstrenget fodfæste sekvens, gennem hvilke DNA molekyler af interesse (som indeholder den “fortrænger” DIS sekvens) kan være vedhæftet via fodfæste-medieret strand invasion.
Mens Bephore er potentielt enklere at gennemføre, Daisy tillader realiseringen af meget tætte og rene “gen pensler”, som har fordele i visse anvendelser. I princippet, men kunne Daisy og Bephore litografi nemt kombineres. En beslægtet litografi metode udnytter DNA streng forskydning for strukturering DNA børster på guld var tidligere udviklet af Huang et al., men blev ikke udnyttet i forbindelse med celle-fri gen expression28,29.
I følgende protokol giver vi en detaljeret beskrivelse af produktionen af DNA børster for celle-fri genekspression ved hjælp af metoden Bephore. Vi beskriver hvordan gen chips er fabrikeret og demonstrere brugen af Multi-trins foto-litografi for den rumligt struktureret immobilisering af gener på en chip. Vi diskuterer også fabrikation af reaktion kamre og anvendelsen af mikrofluidik for udførelsen af på chip gen expression reaktioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bephore litografi er en robust og alsidig teknik for den mønstrede immobilisering af DNA eller RNA. Endnu, proceduren, der omfatter flere trin, som – hvis ændret – kan være en kilde til fejl eller reduceres systemets ydeevne.
Et afgørende skridt i fabrikation af Bephore chips er PEGylation af substrat, som giver biokompatibilitet af overfladen. Her er trinnet rengøring med en RCA procedure vigtigt, da det også aktiverer overflade for den efterfølgende silanisering. Under den faktiske PE…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi parlamentsarbejdet finansiel støtte til dette projekt af Volkswagen Stiftung (grant nr. 89 883) og det Europæiske Forskningsråd (grant aftale nr. 694410 – AEDNA). M.S.-S. anerkender støtte af DFG gennem GRK 2062.
Materials
| Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100 | |
| Silicon wafer (for PDMS master mold) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”) | |
| Glass slides no. 4 | Menzel | 22 mm x 50 mm | |
| Glass slides no. 1.5 | Assistent | 24 mm x 24 mm | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| Anhydrous toluene | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| DNA | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | PCR kit |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Spin-column PCR clean-up kit |
| PURExpress | New England Biolabs | E6800S | Cell-free expression system |
| PDMS | Dow Corning | Slygard 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | micro resist technology GmbH | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | micro resist technology GmbH | Photoresist developer | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | Adhesion promoter | |
| Two-component silicon glue | Picodent | Twinsil | |
| UV-protection yellow foil | Lithoprotect (via MicroChemicals) | Y520E212 | |
| Equipment | |||
| Masks for photolithography | Zitzmann GmbH | 64.000 dpi, 180×240 mm | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | Photolithography and fluorescence imaging |
| 60x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.9 |
| 20x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.5 |
| Camera | Photometrics | Coolsnap HQ | Used with Olympus BX51 |
| Ligtht source | EXFO | X-Cite 120Q | Used with Olympus BX51 |
| Inverted microscope | Nikon | Ti2-E | Fluorescence imaging of gene expression |
| 4x objective | Nikon | CFI P-Apo 4x Lambda | Used with Nikon Ti2-E |
| Camera | Andor | Neo5.5 | Used with Nikon Ti2-E |
| Light source | Lumencor | SOLA SM II | Used with Nikon Ti2-E |
| Cage incubator | Okolab | bold line | Used with Nikon Ti2-E |
| Pressure Controller | Elveflow | OB1 MK3 | |
| NanoPhotometer | Implen | DNA concentration measurement | |
| Plasma cleaner | Diener | Femto | 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage |
Referências
- Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
- Jaehme, M., Michel, H. Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins – a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus. The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).
- Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).
- Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Estévez-Torres, A., et al. Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).
- Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance. Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System. Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
- Maeda, Y. T., et al. Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).
- Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, e09771 (2015).
- Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), 299-304 (2005).
- Pohorille, A., Deamer, D. Artificial cells: prospects for biotechnology. Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).
- van Nies, P., et al. Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells. Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).
- Buxboim, A., et al. A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips. Small. 3 (3), 500-510 (2007).
- Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface. Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).
- Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes. Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).
- Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. Compartmentalization by directional gene expression. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).
- Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345 (6198), 829-832 (2014).
- Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells. Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).
- Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography. Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).
- Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. Multicolor and Erasable DNA Photolithography. ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).
- Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction. Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).
- McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).
