Functionele oppervlak-immobilisatie van genen met behulp van meerstaps Strand Displacement lithografie
Summary
Op een ondergrond, die kan worden gebruikt voor het uitvoeren van cel-vrije gen expressie experimenten op biochips beschrijven we een eenvoudige lithografische procedure voor de immobilisatie van gen-lengte DNA moleculen.
Abstract
Immobilisatie van genen op lithographically gestructureerde oppervlakken kan de studie van verzuilde gen expressie processen in een open microfluidic bioreactor systeem. In tegenstelling tot andere benaderingen naar kunstmatige cellulaire systemen zorgt een dergelijke opstelling voor een continue aanvoer gen expressie reagentia en gelijktijdige aftappen van afvalproducten. Dit vergemakkelijkt de tenuitvoerlegging van cel-vrije gen expressie processen gedurende langere perioden van tijd, die belangrijk is voor de realisatie van dynamische gene regelgevende feedbacksystemen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de fabrikatie van genetische biochips met behulp van een eenvoudige-en-klare lithografische techniek gebaseerd op DNA strand displacement reacties, die uitsluitend verkrijgbare onderdelen gebruikt. We bieden ook een protocol over de integratie van de verzuilde genen met een Polydimethylsiloxaan (PDMS)-gebaseerde microfluidic systeem. Bovendien laten we zien dat het systeem compatibel is met totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie, die kan worden gebruikt voor de directe observatie van moleculaire interacties tussen DNA en de moleculen die zijn opgenomen in de expressie mix.
Introduction
Cel-gratis genexpressie reacties van groot belang voor diverse toepassingen in de biochemie, biotechnologie en synthetische biologie zijn. Cel-vrije expressie van eiwitten speelde voor de bereiding van zuivere EiwitSteekproeven, die de basis voor tal van studies in de structurele biologie vormden. Bijvoorbeeld, werden cel-vrije systemen met succes gebruikt voor de expressie van eiwit complexen1 of membraan eiwitten2, die zijn moeilijk te produceren met behulp van cel-gebaseerde expressie. Met name, cel-gratis genexpressie reacties ook gebruikt werden om het verhelderen van de structuur van de genetische code, beginnend met de baanbrekende experimenten door Nirenberg en Matthaei in 19613.
Onlangs is er een hernieuwde belangstelling voor cel-vrije methoden in de biotechnologie en synthetische biologie4,5,6. Cel-vrije systemen kunnen worden aangevuld met niet-biologische verbindingen, en onderdelen van diverse biologische oorsprong is cumuleerbaar gemakkelijker7. Hoewel cel-vrije systemen hebben de schijnbare nadeel dat ze niet “groeien en verdelen”, is het denkbaar om te bereiden open cel-vrije bioreactoren met metabole basisfuncties en laat ze synthetiseren metabolieten wanneer voorzien van eenvoudige koolstof en energie ingangen8. Op het opkomende gebied van synthetische biologie beloven cel-vrije systemen om een meer voorspelbare “chassis” voor de uitvoering van synthetische biologische functies.
Momenteel, cel-vrije gen expressie reacties worden uitgevoerd hetzij met behulp van cel haalt (uit verschillende bronnen, zoals bacteriën, gist, insecten), of transcriptie/vertaling-systemen die zijn geoptimaliseerd voor verschillende toepassingen (bijvoorbeeld prokaryote vs. Eukaryotische genexpressie, productie van membraaneiwitten, enz.). Een populair protocol voor de bereiding van het extract van de bacteriële cel (vaak genoemd TXTL) is onlangs geleverd door V. Noireaux en collega’s9. De biofysische eigenschappen geweest grondig gekarakteriseerd10, en het TXTL-systeem heeft al met succes gebruikt voor het uitvoeren van een reeks complexe biochemische taken: bijvoorbeeld, de vergadering van functionele bacteriofagen via cel-vrije expressie van de bacteriofaag genoom11, de synthese van de bacteriële eiwitten door samensmelting van filamenten12of de uitvoering van cel-vrije gene circuits13,14.
Een ander systeem populair in cel-vrij van synthetische biologie is het PURE systeem, dat opnieuw is samengesteld uit gezuiverde onderdelen15,16. Vergeleken met het TXTL-systeem, bevat het geen nucleasen of eiwit afbraak machines. Terwijl de afbraak van lineaire DNA is RNA-moleculen of eiwitten minder een probleem in het PURE systeem, verval trajecten zijn eigenlijk belangrijk is voor de uitvoering van dynamische functies. Teneinde het effect van exonuclease afbraak van lineaire gene sjablonen in het TXTL systeem (via RecBCD), dient het eiwit GamS beveiligen met een einde te worden toegevoegd. Zowel de TXTL als het PURE systeem zijn commercieel verkrijgbaar.
Een onderwerp verwant nauw aan cel-vrije biologie betreft de studie van het effect van de brandcompartimentering op biochemische reacties, en verder de oprichting van kunstmatige cel-achtige structuren of protocells17,18,19 ,20. Onderzoek naar kunstmatige cellen betekent meestal dat de inkapseling van een biochemische reactie systeem binnenkant van vesiculaire compartimenten fosfolipiden of andere amfifielen in mindering gebracht. Hoewel dergelijke systemen helpen om fundamentele aspecten van brandcompartimentering, of de opkomst van buiten en zelfreplicerende structuren te verkennen, ze geconfronteerd met de typische problemen van gesloten systemen: in het ontbreken van een goed functionerende stofwisseling en passende membraan vervoer mechanismen, is het moeilijk om te houden van de verzuilde Reacties lopen voor langere tijd – brandstof moleculen zijn opgebruikt en afvalstoffen zich ophopen.
Een interessant alternatief voor brandcompartimentering binnenkant van dergelijke cel nabootsen compartimenten is de ruimtelijke organisatie van genetisch materiaal photolithographic referentiemethoden. Immobilisatie van “genen op een chip” was gepionierd door de Bar-Ziv-groep aan het Weizmann Instituut meer dan tien jaar geleden21. Onder de belangrijke kwesties die moesten worden opgelost waren de aspecifieke adsorptie van DNA en de mogelijke denaturatie van eiwitten op het oppervlak van de chip. Bar-Ziv et al. ontwikkelde een speciale fotolithografie weerstaan genoemd “Daisy”, die bestond uit een reactieve terminal silane voor immobilisatie van de moleculen resist op silicium dioxide oppervlakken, een lange polyethyleenglycol (PEG)-spacer die verzekerd biocompatibiliteit en een photocleavable headgroup, die werd omgebouwd tot een reactief amine bij bestraling met ultraviolet (UV) licht. Het is aangetoond dat Daisy kan worden gebruikt voor het immobiliseren van gen-lengte DNA moleculen (met een lengte van enkele kilo-basenparen (kbp)) op een oppervlak van de chip. Vanuit een polymeer natuurkunde oogpunt vertegenwoordigd de systemen polymeer borstels geënt op een stevige ondergrond. Vanwege de aard van de polyelectrolyte van DNA, is de conformatie van deze borstels sterk beïnvloed door osmotische en andere ion-specifieke effecten22,23.
Bovenal is het aangetoond dat substraat-geïmmobiliseerd genen nog steeds functionele zijn en kunnen getranscribeerde en vertaald in RNA en eiwitten. Gene borstels zijn toegankelijk voor RNA polymerase van oplossing24, en de complexe macromoleculaire mengsel van de transcriptie/vertaling is niet gedenatureerd aan het oppervlak. Een van de voordelen van immobilisatie van genetische componenten op een substraat is dat ze kunnen worden bediend in een open microfluidic reactor systeem dat voortdurend wordt geleverd met de voorloper van de kleine moleculen en uit welke afvalstoffen verwijderde25 kunnen , 26.
Wij recent ontwikkelde een variant op deze methode genoemd Bephore (voor biocompatibel elektronenbundel en fotoresist)27, die was uitsluitend gebaseerd op verkrijgbare onderdelen en volgorde-specifieke DNA strand invasie reacties voor gebruikt de realisatie van een eenvoudig te implementeren meerstaps litho-procedure voor de oprichting van chip gebaseerde kunstmatige cellen. Een schematisch overzicht van de procedure is afgebeeld in Figuur 1. Het is gebaseerd op DNA haarspeld moleculen bevat een photocleavable-groep, die zijn geïmmobiliseerd op een biocompatibele PEG-laag. Photocleavage van de haarspeld bloot een single-stranded steunpunt reeks, door welke DNA moleculen van belang (met de “displacing” DIS volgorde) aangesloten via steunpunt-gemedieerde strand invasie worden kunnen.
Terwijl Bephore mogelijk eenvoudiger is te implementeren, Daisy laat de realisatie van de zeer dichte en schoon “gene borstels”, die heeft voordelen in bepaalde toepassingen. In principe echter kan Daisy en Bephore lithografie gemakkelijk gecombineerd worden. Een verwante lithografie methode met behulp van DNA strand verplaatsing voor het structureren van DNA borstels op goud werd eerder ontwikkeld door Huang et al., maar werd niet gebruikt in het kader van cel-vrije gen expressie28,29.
In het volgende protocol bieden wij dat een gedetailleerde beschrijving van de productie van DNA borstels voor cel-vrije genexpressie met behulp van de methode Bephore. We beschrijven hoe de gene chips zijn vervaardigd en voorbeelden van het gebruik van meerdere stappen foto-lithografie voor het ruimtelijk gestructureerde immobilisatie van genen op een chip. We bespreken ook de fabricage van reactie kamers en de toepassing van microfluidics voor de uitvoering van de op de chip gen expressie reacties.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bephore lithografie is een robuuste en veelzijdige techniek voor het patroon immobilisatie van DNA of RNA. Nog, is de procedure omvat verschillende stappen, die – gewijzigd – kunnen er een oorzaak voor de storing of verminderde prestaties van het systeem.
Een cruciale stap in de fabricage van Bephore chips is de PEGylation van de drager vervagen, waardoor de biocompatibiliteit van het oppervlak. Hier, is de schoonmaak stap met een RCA-procedure belangrijk, omdat het ook het oppervlak voor de l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We mijn dankbaarheid uitspreken aan financiële steun voor dit project door de Volkswagen-Stiftung (grant nr. 89 883) en de European Research Council (subsidie overeenkomst nr. 694410 – AEDNA). M.S.-S. ondersteuning door de DFG via GRK 2062 erkent.
Materials
| Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100 | |
| Silicon wafer (for PDMS master mold) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”) | |
| Glass slides no. 4 | Menzel | 22 mm x 50 mm | |
| Glass slides no. 1.5 | Assistent | 24 mm x 24 mm | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| Anhydrous toluene | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| DNA | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | PCR kit |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Spin-column PCR clean-up kit |
| PURExpress | New England Biolabs | E6800S | Cell-free expression system |
| PDMS | Dow Corning | Slygard 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | micro resist technology GmbH | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | micro resist technology GmbH | Photoresist developer | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | Adhesion promoter | |
| Two-component silicon glue | Picodent | Twinsil | |
| UV-protection yellow foil | Lithoprotect (via MicroChemicals) | Y520E212 | |
| Equipment | |||
| Masks for photolithography | Zitzmann GmbH | 64.000 dpi, 180×240 mm | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | Photolithography and fluorescence imaging |
| 60x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.9 |
| 20x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.5 |
| Camera | Photometrics | Coolsnap HQ | Used with Olympus BX51 |
| Ligtht source | EXFO | X-Cite 120Q | Used with Olympus BX51 |
| Inverted microscope | Nikon | Ti2-E | Fluorescence imaging of gene expression |
| 4x objective | Nikon | CFI P-Apo 4x Lambda | Used with Nikon Ti2-E |
| Camera | Andor | Neo5.5 | Used with Nikon Ti2-E |
| Light source | Lumencor | SOLA SM II | Used with Nikon Ti2-E |
| Cage incubator | Okolab | bold line | Used with Nikon Ti2-E |
| Pressure Controller | Elveflow | OB1 MK3 | |
| NanoPhotometer | Implen | DNA concentration measurement | |
| Plasma cleaner | Diener | Femto | 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage |
Referências
- Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
- Jaehme, M., Michel, H. Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins – a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus. The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).
- Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).
- Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Estévez-Torres, A., et al. Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).
- Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance. Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System. Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
- Maeda, Y. T., et al. Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).
- Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, e09771 (2015).
- Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), 299-304 (2005).
- Pohorille, A., Deamer, D. Artificial cells: prospects for biotechnology. Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).
- van Nies, P., et al. Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells. Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).
- Buxboim, A., et al. A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips. Small. 3 (3), 500-510 (2007).
- Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface. Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).
- Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes. Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).
- Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. Compartmentalization by directional gene expression. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).
- Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345 (6198), 829-832 (2014).
- Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells. Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).
- Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography. Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).
- Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. Multicolor and Erasable DNA Photolithography. ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).
- Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction. Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).
- McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).
