다단계 가닥 변위 리소 그래피를 사용 하 여 유전자의 기능 표면-동원 정지
Summary
우리는 봄에는에 셀 무료 유전자 식 실험을 수행 하기 위해 사용 될 수 있는 표면에 유전자 길이 DNA 분자의 동원 정지에 대 한 간단한 석판 절차를 설명 합니다.
Abstract
있고 구조화 된 표면에 유전자의 동원 정지에 오픈 미세 생물 반응 기 시스템에서 식 프로세스를 compartmentalized 유전자의 연구 수 있습니다. 인공 세포 시스템으로 다른 접근, 달리 등 설치 유전자 표현 시 약 및 동시 배출 폐기물의 지속적인 공급에 대 한 수 있습니다. 이 동적 유전자 규정 피드백 시스템의 실현을 위한 중요 한 시간의 연장된 기간 동안 셀 무료 유전자 식 프로세스의 구현을 지원 합니다. 여기 우리 기술을 사용 하 여는 사용 하기 간단 석판 DNA 가닥 변위 반응에 따라 독점적으로 상업적으로 사용 가능한 구성 요소를 사용 하 여 유전 봄에는 제작에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 우리 또한 제공 하는 프로토콜 compartmentalized 유전자의 통합에입니다 (PDMS)-미세 시스템을 기반으로. 또한, 우리는 시스템 DNA와 식 믹스에 포함 된 분자 사이 분자 상호 작용의 직접적인 관측을 위해 사용 될 수 있는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경과 호환 되는지 보여줍니다.
Introduction
세포-유전자 발현 반응 생화학, 생명 공학, 및 합성 생물학에 다양 한 응용 프로그램에 대 한 큰 관심은 무료. 단백질 세포 자유로운 표현의 구조 생물학에서 수많은 연구를 위한 기초를 했다 순수 단백질 견본의 준비를 위한 수단이 되었다. 예를 들어, 셀-무료 시스템 성공적으로 어려운 셀 기반으로 식을 사용 하 여 생산 하는 단백질 단지1 또는 막 단백질2의 식에 사용 되었다. 특히, 셀-무료 유전자 발현 반응 했다 또한 19613Nirenberg 그리고 Matthaei에 의해 획기적인 실험과 함께 시작 하는 유전 코드의 구조를 명료 하 게 하는 데 사용 됩니다.
최근, 생명 공학 및 합성 생물학4,,56셀 자유로운 방법에 관심을 갱신된 되었습니다. 셀-무료 시스템 비 생물학 화합물, 증강 될 수 및 다양 한 생물학 근원의 부품을 보다 쉽게 결합 될 수 있다7. 비록 셀 무료 시스템 명백한 단점은 “성장 하 고 분할” 하지 않습니다, 그것은 오픈 셀 무료 bioreactors 기본적인 신진 대사 기능을 준비 하 고 합성 대사 간단한 탄소 및 에너지 제공 하는 때 그들을 입력8. 합성 생물학의 신흥 분야, 내 셀 무료 시스템 예측 “섀시” 구현 위한 합성 생물학 기능 되도록 약속 드립니다.
현재, 셀-무료 유전자 식 반응 중 하나를 사용 하 여 수행 됩니다 (다른 소스에서 박테리아, 효 모, 곤충 등), 셀 추출 또는 다른 응용 프로그램 (예를 들어, 최적화 된 전사/번역 시스템 간결한 대 진 핵 유전자 식, 막 단백질 등의 생산). 세균성 세포 추출 물 (일반적으로 TXTL에 게 불리는)의 준비에 대 한 인기 있는 프로토콜 V. Noireaux와 동료9에의해 최근 제공 했다. 생물 속성 철저 하 게 특징이10, 그리고 TXTL 시스템은 이미 성공적으로 사용 되어 일련의 복잡 한 생 화 확 적인 작업을 수행 하기 위해: 예를 들어, 을 통해 기능 살 균 소의 어셈블리 셀-무료 식 살 균 소 게놈11, 세균성 단백질 필 라 멘 트12, 합성 또는 셀 무료 유전자 회로13,14의 구현입니다.
셀-무료 합성 생물학에서 인기 있는 또 다른 시스템은 정화 부품15,16에서 재구성 순수한 시스템. TXTL 시스템에 비해, 그것은 포함 하지 않는다 nucleases 또는 단백질 저하 기계. 동안 선형 DNA의 저하, RNA 분자 또는 단백질은 문제점의 더 적은 순수한 시스템에서 충 경로 실제로 동적 기능 구현에 대 한 중요 한. (RecBCD)를 통해 TXTL 시스템에서 선형 유전자 템플릿의 exonuclease 저하의 영향을 줄이기 위해 최종 보호 GamS 단백질을 추가할 수 있다. TXTL와 순수 시스템 모두 상업적으로 사용할 수 있습니다.
주제를 밀접 하 게 관련 셀 무료 생물학 문제에 생 화 확 적인 반응에 구획의 효과 및 추가 인공 세포와 같은 구조 또는 protocells17,18,19의 창조의 연구 ,20. 인공 세포에 대 한 연구는 일반적으로 내부 기공을 구획 인지질 또는 다른 amphiphiles에서 만든 생 화 확 적인 반응 시스템의 캡슐화를 포함 한다. 동안 이러한 시스템 구획의 근본적인 측면 또는 cellularity 각자 복제의 출현을 탐구 하는 데 도움이, 그들은 폐쇄 시스템의 일반적인 문제를 직면 하는 것: 작동 물질 대사 및 적절 한 부재에 막 전송 메커니즘, 그것은 한정된 반응 시간의 연장된 기간에 대 한 실행을 계속 하기 어려운-연료 분자 사용 되 고 폐기물 축적.
이러한 셀을 흉내 낸 구획 내부 구획에 흥미 있는 대안 photolithographic 방법을 사용 하 여 유전 물질의 공간 조직 이다. “칩에 유전자”의 동원 정지 바이 츠만 연구소에 바-Ziv 그룹으로 10 여 년 전 개척 했다21. 주요 문제를 확인할 수 있도록 했다 중 DNA의 일반적인 흡착 및 칩 표면에 단백질의 잠재적인 변성 했다. 바-Ziv 외. “데이지”, immobilization 이산화 규소 표면에 저항 분자의 긴 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 스페이서 보장에 대 한 반응성 터미널 실 란의 구성 되었다 불리는 전용된 사진 평판 저항 개발 생체 적합성, 그리고 방사선 자외선 (UV) 빛에 따라 반응 아민으로 개조 되었다 photocleavable headgroup. 그것은 데이지 유전자 길이 DNA 분자 (몇 킬로 기본적인 쌍 (kbp)의 길이)와 칩 표면에 고정 하는 데 사용 될 수 표시 되었습니다. 고분자 물리학의 관점에서 시스템 고체 기판에 융합 하는 고분자 브러쉬 표시. DNA의 전해질 특성상 이러한 브러시의 구조는 삼 투 및 기타 이온 특정 효과22,23강력 하 게 영향을.
가장 중요 한 것은, 그것은 기판 움직일 유전자 여전히 작동 하 고 베낀 고로 번역 해 RNA와 단백질 수 표시 되었습니다. 유전자 브러쉬 솔루션24에서 RNA polymerases 액세스할 수 있습니다 그리고 녹음/번역의 복잡 한 고분자 혼합물은 표면에 변성 되지. 기판에 유전 구성의 동원 정지의 장점 중 하나는 그들은 작은 선구자 분자와 어떤 폐기물 제거25 수에서 지속적으로 제공 하는 열린 미세 반응 기 시스템에서 동작할 수 있습니다. , 26.
우리는 최근 변종 (생체 전자 빔 및 감광 제)에 대 한 Bephore27, 상업적으로 사용 가능한 구성 요소에 독점적으로 근거 했다 하 고 시퀀스 특정 DNA 가닥 침공에 대 한 반응을 활용 되 나이 방법의 개발 칩 기반 인공 세포의 생성에 대 한 간단한 구현 다단계 리소 그래피 절차의 실현. 절차의 개요 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 그것은 DNA 머리 핀 분자 photocleavable 그룹을 포함 하는 생체 못 레이어에 움직일을 기반으로 합니다. Photocleavage는 머리 핀의 어떤 DNA를 통해 (“전치” 표시 시퀀스를 포함 하는)의 분자 발 중재 가닥 침략에 연결 된 를 통해 수 단일 가닥 발 시퀀스를 제공 합니다.
데이지의 매우 조밀 하 고 깨끗 한 수 Bephore 잠재적으로 간단 하 게 구현 하는, “유전자 브러쉬”, 특정 응용 프로그램에서 장점을. 그러나 원칙적으로,, 데이지와 Bephore 석판 수 쉽게 결합. DNA를 구성 하기 위한 DNA 가닥 변위 골드 브러쉬 활용 관련된 리소 그래피 방법 이전 황 외.에 의해 개발 되었다 하지만 하지 셀 무료 유전자 식28,29의 문맥에서 이용 되었다.
다음 프로토콜 Bephore 메서드를 사용 하 여 셀 무료 유전자 발현에 대 한 브러쉬 DNA의 생산에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다. 우리는 유전자 칩 조작 방법과 칩에 유전자의 공간 구조적된 동원 정지에 대 한 다단계 포토 리소 그래피의 사용을 설명 합니다. 우리는 또한 반응 챔버의 제조 및 마이크로 칩에 유전자 식 반응의 성능에 대 한 응용 프로그램 토론.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bephore 리소 그래피는 DNA 또는 RNA의 꽃무늬 동원 정지에 대 한 강력 하 고 다재 다능 한 기술입니다. 그러나, 절차-변경-실패에 대 한 원천이 될 수 있습니다 몇 가지 단계를 포함 하거나 시스템의 성능 감소.
Bephore 칩의 제조에 중요 한 단계는 표면의 생체 적합성을 제공 하는 기판의 PEGylation 이다. 여기, RCA 절차와 청소 단계 중요 하다, 때문에 그것은 또한 후속 silanization에 대 한…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 기꺼이 폭스바겐 재단 (부여 번호 89 883)와 유럽 연구 위원회 (보조금 계약 번호 694410-AEDNA)이이 프로젝트에 대 한 재정 지원을 인정 한다. 석사-미 지원을 통해 GRK 2062 DFG 인정합니다.
Materials
| Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100 | |
| Silicon wafer (for PDMS master mold) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”) | |
| Glass slides no. 4 | Menzel | 22 mm x 50 mm | |
| Glass slides no. 1.5 | Assistent | 24 mm x 24 mm | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| Anhydrous toluene | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| DNA | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | PCR kit |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Spin-column PCR clean-up kit |
| PURExpress | New England Biolabs | E6800S | Cell-free expression system |
| PDMS | Dow Corning | Slygard 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | micro resist technology GmbH | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | micro resist technology GmbH | Photoresist developer | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | Adhesion promoter | |
| Two-component silicon glue | Picodent | Twinsil | |
| UV-protection yellow foil | Lithoprotect (via MicroChemicals) | Y520E212 | |
| Equipment | |||
| Masks for photolithography | Zitzmann GmbH | 64.000 dpi, 180×240 mm | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | Photolithography and fluorescence imaging |
| 60x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.9 |
| 20x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.5 |
| Camera | Photometrics | Coolsnap HQ | Used with Olympus BX51 |
| Ligtht source | EXFO | X-Cite 120Q | Used with Olympus BX51 |
| Inverted microscope | Nikon | Ti2-E | Fluorescence imaging of gene expression |
| 4x objective | Nikon | CFI P-Apo 4x Lambda | Used with Nikon Ti2-E |
| Camera | Andor | Neo5.5 | Used with Nikon Ti2-E |
| Light source | Lumencor | SOLA SM II | Used with Nikon Ti2-E |
| Cage incubator | Okolab | bold line | Used with Nikon Ti2-E |
| Pressure Controller | Elveflow | OB1 MK3 | |
| NanoPhotometer | Implen | DNA concentration measurement | |
| Plasma cleaner | Diener | Femto | 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage |
Referências
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