Flow Cytometric påvisning af nydannede brystkræft stamceller-lignende celler efter apoptose tilbageførsel
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at isolere apoptotiske brystkræftceller af fluorescens-aktiveret celle sortering og yderligere opdage overgang af ikke-stamceller brystkræftceller til brystkræft stamceller-lignende celler efter apoptose vending ved flowcytometri.
Abstract
Kræft tilbagefald er længe blevet undersøgt af onkologer, mens de underliggende mekanismer er uklare. For nylig har fandt vi og andre, at et fænomen kaldet apoptose tilbageførsel fører til øget tumorigenisitetsforsøg i forskellige cell modeller under forskellige stimuli. Tidligere undersøgelser har været fokuseret på sporing denne proces in vitro- og in vivo; dog har isolering af virkelige tilbageførte celler endnu skal opnås, hvilket begrænser forståelsen af konsekvenserne af apoptose tilbageførsel. Her, drage vi fordel af en Caspase-3/7 grøn påvisning farvestof til etiketten celler med aktiveret caspases efter apoptotiske induktion. Celler med positive signaler er yderligere sorteret af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) til nyttiggørelse. Morfologiske undersøgelse under konfokalmikroskopi hjælper bekræfte apoptotiske status før FACS. En stigning i tumorigenisitetsforsøg kan ofte henføres til elevation i procentdelen af kræft stamceller (CSC)-gerne celler. Også, da heterogenitet af brystkræft, at identificere oprindelsen af disse CSC-lignende celler ville være afgørende for kræftbehandling. Dermed, vi forbereder brystkræftceller for ikke-stamceller før udløser apoptose, isolere caspase-aktiverede celler og udfører apoptose tilbageførsel procedure. Flow flowcytometri analyse viser, at brystkræft CSC-lignende celler vises igen i omvendt gruppen, med angivelse af brystkræft CSC-lignende celler er passeres fra ikke-stamceller brystkræftceller under apoptose tilbageførsel. I Resumé omfatter denne protokol isolering af apoptotiske brystkræftceller og påvisning af ændringer i CSC procentdel i tilbageførte celler ved flowcytometri.
Introduction
Kræft har været en førende årsag til død, forårsager tung byrde at lande over hele verden1. Brystkræft rangerer højt, både hvad angår forekomst og dødelighed hos kvindelige patienter blandt alle typer af kræft1. På grund af kræft heterogenitet bruges en kombination af narkotika som regel i kemoterapi for kræft celle død2,3,4. Men da fælles kemoterapeutiske stoffer ofte målrette DNA5,6, protein syntese7,8 og/eller mikrotubulus dynamics9, hurtigt voksende celler er påvirket mest mens inaktiv celler såsom kræft stamceller (CSC) s er som regel mindre påvirket10. CSCs er derfor mere tilbøjelige til at overleve efter den behandling, som senere fører til lægemiddelresistens og kræft tilbagefald10,11. Derfor, afskaffelse af CSCs er blevet et vigtigt emne for kræftbehandling og undersøgelse af CSCs oprindelse er nødvendig.
Flere undersøgelser om fænomenet af apoptose tilbageførsel er blevet udført i det seneste årti12,13,14,15,16,17,18 , 19. før fremkomsten af dette begreb, det er blevet almindeligt accepteret at celler uigenkaldeligt vil gennemgå apoptose efter caspase aktivering. Caspases er en familie af protein enzymer, der spiller vigtige roller i indledningen og udførelse stadier af apoptose, herunder dannelsen af de apoptotiske komplekse og kløvningen af downstream substrater20. Aktivering af bøddel caspases såsom caspase 3 eller caspase 7 har været betragtet som “point of no return” for apoptose21. Men forskere for nylig observeret at apoptose tilbageførsel opstår både in vitro- og in vivo, under hvilke celler kan gendanne fra apoptose selv efter caspase aktivering12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Desuden aggressive funktioner såsom højere modstand mod den oprindelige apoptotiske inducer og højere invasionsevne registreres i den tilbageførte kræft celler15. Derfor blev det foreslået, at procentdelen af CSC-lignende celler ville være højere i den tilbageførte befolkning i forhold til de ubehandlede celler, i sidste ende bidrager til de mere ondartet funktioner efter apoptose tilbageførsel18.
Tidligere, mange har gjort en indsats til at spore den apoptose vending i vitro og endnu vigtigere, in vivo, som i høj grad hjælper bekræfte universelle i denne proces16,17,19. Der mangler dog en systemisk undersøgelse af konsekvenser af omvendt celler på grund af den utilfredsstillende isolation af celler, der har virkelig været underkastet apoptose tilbageførsel. Der er behov for at erhverve rene apoptotiske celler og gendanne dem til yderligere undersøgelse. Dermed, vi bruger den traditionelt godt accepteret markør af bøddel caspase aktivering som markør af “point of no return”21 for apoptose og udnytte fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) for at diskriminere caspase-aktiverede celler farves med Caspase-3/7 grøn påvisning farvestof. Farvestoffet er kovalent kædet sammen med en kort aminosyresekvens DEVD, som kan genkendes og kløvet af aktive caspases 3/7. Kløvningen hjælper med at frigive farvestof, som vil translocate fra cytosol til kernen hvor det binder sig til DNA og udsender stærke fluorescens. Denne procedure undgås ved hjælp af en bulk celle population, ikke kan nogle celler har undergået apoptose.
CSCs eller tumor-indlede celler er blevet identificeret i mange solide tumorer ved hjælp af et enkelt eller en kombination af flere overflade marker(s) og meget få antallet af disse celler er tilstrækkelige til at form tumorer hos immundefekte mus22,23, 24,25,26,27. En kombination af CD44 og CD24 har været almindeligt anvendt i bryst CSC undersøgelser, og CD44+/CD24– celler har været defineret som bryst CSCs26,27,28,29 , 30. for nylig, vi har udført en række eksperimenter for at bekræfte den foreslåede forhold mellem apoptose tilbageførsel og CSCs og demonstrere at tilbageførte brystkræftceller fået øget tumor-dannende evne in vitro- og in vivo med en forhøjede procentdel af celler med CSC markører18. Selv om vi ikke kunne udelukke muligheden for, at bryst CSCs overleve bedre og dermed få beriget efter apoptose tilbageførsel, især når vi isolere ikke-stamceller kræftceller og emne dem til apoptose tilbageførsel, CSC vil dukke op i den oprindeligt ikke-stamceller kræft celle population, tyder på, at ikke-stamceller kræft celler kan bidrage til stigningen i procentdelen af CSCs under apoptose tilbageførsel.
Denne artikel har til formål at demonstrere overgangen fra ikke-stamceller brystkræftceller til brystkræft CSC-lignende celler efter apoptose vending og til at opdage denne overgang ved flowcytometri. De ikke-stamceller brystkræftceller er oprindeligt udarbejdet ved at isolere CD44–/CD24+ bryst kræftceller af FACS. Derefter er apoptose induceret og bekræftet af morfologiske ændringer under mikroskop. Bagefter, apoptotiske celler positivt mærket af Caspase 3/7 grøn påvisning farvestof er isoleret af FACS og yderligere kulturperler i mangel af apoptotiske induktorer til apoptose tilbageførsel. De tilbageførte celler er derefter farves med CSC markører efter 7 dage af recovery for flow cytometric analyse. Celler med CD44+/CD24– markører vises igen i den tilbageførte befolkning, tyder på, at overgangen fra ikke-stamceller kræftceller til CSC-lignende celler er opstået under apoptose tilbageførsel.
Apoptose tilbageførsel er blevet observeret i flere kræft cellelinjer samt normale primærelementer behandlet med forskellige apoptotiske stimuli i vitro12,13. Denne proces er også blevet spores i Drosophila model in vivo16,17,19. Mange oplysninger om den underliggende mekanisme for kræft tilbagefald i forskellige kræft sygdomsmodeller og oprindelsen af CSCs kan opnås ved hjælp af teknikken, som beskrevet i dette håndskrift.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en direkte og klar måde til påvisning af ikke-stamceller brystkræftceller overgang ind breast CSC-lignende celler som følge af apoptose tilbageførsel. Bekræftelse af CSC egenskaber af disse tilbageførte celler kunne bistås ved hjælp af jegn vitro mammosphere dannelse assay og i vivo xenograft transplantation i immundefekte mus18,24,26 ,27<sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af den Innovative teknologi fond af Innovation teknologi Kommissionen: finansiering støtte fra den statslige nøglen laboratorium af Agrobiotechnology (CUHK), Lo Kwee-Seong biomedicinsk forskningsfond og Lee Hysan Foundation. Y.X. blev støttet af den postgraduate studentship fra CUHK.
Materials
| MCF-7 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| T47D | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-133 | |
| Reagent | |||
| 0.05% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| Alexa Fluor 680 annexin V conjugate | Invitrogen | A35109 | |
| bovine serum albumin | USB | 9048-46-8 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye | Invitrogen | C10423 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | heat-inactivated |
| HEPES | USB | 16926 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| monoclonal antibodies against human CD24 | BD Biosciences | 555428 | PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822 |
| monoclonal antibodies against human CD44 | BD Biosciences | 560531 | PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
| PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences | 554648 | Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 558304 | Clone:27-35 RRID:AB_647257 |
| phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium | Invitrogen | 11835055 | phenol red-free |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| staurosporine | Sigma-Aldrich | S4400 | |
| Equipment | |||
| 100 mm culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | |
| 12-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
| Cell Strainer 40-μm nylon mesh | BD Biosciences | 08-771-1 | |
| FACSuite software bundle v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
| FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
| FluoView FV1000 confocal microscope | Olympus | IX81 | 60X objective |
| FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b | Olympus | – | |
| round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| S3e sorter | Bio-Rad | 1451006 |
Referências
- McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
- Slamon, D. J., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).
- Geyer, C. E., et al. Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).
- Cameron, D., et al. A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses. Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).
- Liu, L. F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).
- Hertel, L. W., et al. Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2′,2′-difluoro-2′-deoxycytidine). Pesquisa do Câncer. 50 (14), 4417-4422 (1990).
- Ni, H., et al. Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis. British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).
- Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy. Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
- Pirozzi, G., et al. Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer. Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).
- Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).
- Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).
- Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis. Cancer Cell International. 13 (1), 63 (2013).
- Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).
- Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Scientific Reports. 5, 9015 (2015).
- Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation. Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).
- Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Li, J., Yuan, J. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).
- Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death. Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Pesquisa do Câncer. 63 (18), 5821-5828 (2003).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
- O’Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Cioffi, M., et al. Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer. Scientific Reports. 5, 10357 (2015).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Pesquisa do Câncer. 65 (13), 5506-5511 (2005).
- Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).
- Sheridan, C., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast Cancer Research. 8 (5), R59 (2006).
- Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation. Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).
- Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).
- Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).
- Saunders, D. E., et al. Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells. International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).
- Miller, A. V., et al. Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor. PLoS One. 8 (4), e60685 (2013).
- Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
- Ng, S. Y., et al. Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).
- Lo, I. C., et al. TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).
- Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).
- Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
- Desiderio, V., et al. Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells. Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).
- Gupta, P. B., et al. Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells. Cell. 146 (4), 633-644 (2011).
