Fluxo Cytometric deteção da recém-formada mama câncer células-tronco células após a reversão de apoptose
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para isolar células de câncer de mama apoptotic classificando fluorescência-ativado da pilha e detectar ainda mais a transição de células-tronco de câncer de mama para células de células-tronco, como câncer de mama após a reversão de apoptose por citometria de fluxo.
Abstract
Recorrência de câncer há muito tempo tem sido estudada por oncologistas, enquanto os mecanismos subjacentes permanecem obscuros. Recentemente, nós e os outros encontraram que um fenômeno chamado apoptose inversão leva a aumentada tumorigenicidade em vários modelos de célula sob diferentes estímulos. Estudos anteriores concentraram-se em localizar este processo in vitro e in vivo; no entanto, o isolamento de células real invertidas ainda tem de ser alcançado, que limita a nossa compreensão sobre as consequências da inversão de apoptose. Aqui, aproveitamos uma tintura de deteção de Caspase-3/7 verde para células de rótulo com caspases ativadas após a indução da apoptose. Células com sinais positivos são mais separadas por fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação para a recuperação. Análise morfológica sob microscopia confocal ajuda a confirmar o status de apoptotic antes FACS. Um aumento de tumorigenicidade muitas vezes pode ser atribuído à elevação no percentual de câncer células-tronco (CSC)-como as células. Também, dada a heterogeneidade do cancro da mama, identificando a origem dessas células CSC-como seria fundamental para o tratamento do câncer. Assim, nos preparamos células-tronco de câncer de mama antes de desencadear a apoptose, isolando células caspase-ativado e executar o procedimento de reversão de apoptose. Análise de citometria de fluxo revela que células de mama CSC-como voltar a aparecer no grupo invertido, indicando células da mama-CSC são transitadas de células-tronco de câncer de mama durante a reversão de apoptose. Em resumo, este protocolo inclui o isolamento de células de câncer de mama apoptotic e detecção de mudanças na percentagem de CSC em células invertidas por citometria de fluxo.
Introduction
Câncer tem sido das principais causas de morte, causando um fardo pesado para países em todo o mundo1. Cancro da mama classifica altamente tanto em termos de incidência e mortalidade em pacientes do sexo feminino entre todos os tipos de câncer1. Devido a heterogeneidade do cancro, uma combinação de drogas é geralmente usada em quimioterapia para alcançar câncer célula morte2,3,4. No entanto, desde medicamentos quimioterápicos comuns muitas vezes alvo de5,de DNA6, dinâmica da proteína síntese7,8 e/ou microtubule9, crescendo rapidamente as células são afetadas mais enquanto células quiescentes, tais como câncer células-tronco (CSC) s são geralmente menos afetados10. CSCs são, portanto, mais chances de sobreviver após o tratamento, que leva mais tarde a resistência às drogas e câncer recaída10,11. Daí, eliminação de CSCs tornou-se um tema importante para o tratamento de câncer e estudo da origem do CSCs é necessário.
Foram realizados mais estudos sobre o fenômeno da reversão de apoptose na recente década12,13,14,15,16,17,18 , 19. antes do surgimento deste conceito, tem sido amplamente aceito que as células irreversivelmente passará por apoptose após a ativação de caspase. Caspases são uma família de enzimas de proteínas que desempenham um papel chave nos estágios de iniciação e execução da apoptose, incluindo a formação de complexos a apoptose e a clivagem de substratos a jusante20. Ativação de caspases carrasco como caspase 3 ou caspase 7 tem sido considerada como o “ponto sem retorno” para apoptose21. No entanto, os pesquisadores observaram recentemente que reversão de apoptose ocorre ambos in vitro e in vivo, , durante o qual células pode recuperar de apoptose, mesmo após a ativação de caspase12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Além disso, características agressivas tais como maior resistência ao indutor de apoptose original e maior capacidade de invasão são detectados no cancer inverteu as células15. Portanto, foi proposto que a percentagem de células CSC seria maior na população invertida quando comparado com as células não tratadas, eventualmente, contribuindo para as características mais malignas após reversão de apoptose18.
Anteriormente, muitos esforços foram feitos para controlar a reversão de apoptose in vitro e, mais importante, in vivo, que ajudar muito em confirmar a universalidade deste processo16,17,19. No entanto, um estudo sistemático sobre as consequências das células invertidas é insuficiente devido o isolamento insatisfatório de células que sofreram genuinamente reversão de apoptose. Há uma necessidade de adquirir pilhas apoptotic puro e recuperá-los para um estudo mais aprofundado. Assim, podemos usar o marcador tradicionalmente bem aceitado de ativação de caspase carrasco como o marcador do “ponto sem retorno”21 para apoptose e utilizar fluorescência-ativado da pilha (FACS) para discriminar caspase-ativado células manchadas de classificação com tintura de deteção de Caspase-3/7 verde. O corante é covalentemente ligado a uma sequência de aminoácidos curto, Cecilia, que pode ser reconhecida e clivada por ativas caspases 3/7. O decote ajuda a liberar a tintura, que vai translocar do citosol para o núcleo onde vincula-se ao DNA e emite forte fluorescência. Este procedimento evita o uso de uma população de células em massa em que algumas células não podem ter sofrido apoptose.
CSCs ou células de tumor-iniciando foram identificadas em muitos tumores sólidos usando um único ou uma combinação de vários marker(s) de superfície e muito poucos números destas células são suficientes para tumores de forma em camundongos imunodeficientes22,23, 24,25,26,27. Uma combinação de CD44 e CD24 tem sido comumente usada em estudos de mama CSC e CD44+/CD24– células foram definidas como o peito CSCs26,,27,28,29 , 30. recentemente, que temos realizado uma série de experimentos para confirmar a relação proposta entre apoptose reversão e CSCs e demonstrar que células de câncer de mama invertida ganharam maior capacidade de formação de tumor in vitro e in vivo com um elevada percentagem de células com CSC marcadores18. Embora nós não poderia excluir a possibilidade de que mama CSCs sobrevivem melhores e, assim, obter enriquecidas após a reversão de apoptose, importante, quando podemos isolar as células-tronco cancerosas e assunto para reversão de apoptose, CSC sairá no originalmente-tronco população de células de câncer, sugerindo que Stema câncer células podem contribuir para o aumento da percentagem de CSCs durante reversão de apoptose.
Este artigo tem como objetivo demonstrar a transição de células-tronco de câncer de mama para CSC células da mama após a reversão de apoptose e para detectar esta transição por citometria de fluxo. As células-tronco de câncer de mama são inicialmente preparadas isolando CD44–/CD24+ de mama células cancerosas por FACS. Em seguida, apoptose é induzida e confirmado por mudanças morfológicas sob o microscópio. Depois, pilhas apoptotic positivamente rotulados pelo corante verde deteção de Caspase 3/7 são isoladas por FACS e mais cultivadas na ausência de indutores de apoptose para reversão de apoptose. As células invertidas então estão manchadas com marcadores de CSC após 7 dias de recuperação para análise de fluxo cytometric. Células com CD44+/CD24 marcadores– re-aparecem na população invertida, sugerindo que transição de células-tronco cancerosas para CSC células ocorreu durante a reversão de apoptose.
Reversão de apoptose tem sido observada em câncer múltiplo linhas celulares, bem como as células primárias normais tratados com apoptotic diferentes estímulos em vitro12,13. Este processo também foi rastreado em Drosophila modelo in vivo de16,17,19. Muita informação sobre o mecanismo subjacente de recidiva de câncer em modelos de câncer de diferentes doenças e a origem do CSCs pode ser obtida através do uso da técnica, conforme descrito neste manuscrito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve uma maneira direta e clara para detectar a transição de células-tronco de câncer de mama em células da mama CSC como resultado da reversão de apoptose. Confirmação das propriedades dessas células invertida CSC poderia assistida usando eun vitro mammosphere formação do ensaio e na vivo transplante de enxerto em camundongos imunodeficientes18,24,26 ,,<sup class="xref…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela inovadora tecnologia fundo de inovação tecnologia Comissão: financiamento de apoio do estado chave laboratório de Agrobiotecnologia (CUHK), o fundo de investigação biomédica Lo Kwee-Seong e a Fundação de Hysan Lee. Y.X. foi apoiada pelo curso de pós-bolsa de estudo do CUHK.
Materials
| MCF-7 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| T47D | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-133 | |
| Reagent | |||
| 0.05% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| Alexa Fluor 680 annexin V conjugate | Invitrogen | A35109 | |
| bovine serum albumin | USB | 9048-46-8 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye | Invitrogen | C10423 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | heat-inactivated |
| HEPES | USB | 16926 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| monoclonal antibodies against human CD24 | BD Biosciences | 555428 | PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822 |
| monoclonal antibodies against human CD44 | BD Biosciences | 560531 | PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
| PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences | 554648 | Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 558304 | Clone:27-35 RRID:AB_647257 |
| phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium | Invitrogen | 11835055 | phenol red-free |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| staurosporine | Sigma-Aldrich | S4400 | |
| Equipment | |||
| 100 mm culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | |
| 12-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
| Cell Strainer 40-μm nylon mesh | BD Biosciences | 08-771-1 | |
| FACSuite software bundle v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
| FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
| FluoView FV1000 confocal microscope | Olympus | IX81 | 60X objective |
| FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b | Olympus | – | |
| round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| S3e sorter | Bio-Rad | 1451006 |
Referências
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