JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Pesquisa do Câncer

Apoptozis ters sonra yeni kurulan meme kanser kök hücre benzeri hücre akış sitometrik algılama

Published: January 26, 2019
doi:
10.3791/58642
, , , ,
1School of Life Sciences,The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory of Agrobiotechnology,The Chinese University of Hong Kong, 3Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education,The Chinese University of Hong Kong, 4Centre for Novel Biomaterials,The Chinese University of Hong Kong

Summary

Burada, apoptotik meme kanseri hücreleri floresan aktif hücre sıralayarak yalıtmak ve daha fazla meme kanseri olmayan kök hücreleri meme kanser kök hücre gibi hücrelere geçişten sonra apoptosis ters akış sitometresi tarafından algılamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Abstract

Temel mekanizmaları belirsiz kalırken Kanser nüks onkolog tarafından uzun eğitim gördü. Son zamanlarda, biz ve diğerleri apoptosis ters adında bir fenomen çeşitli hücre modelleri farklı uyaranlara altında artan tumorigenicity yol açar bulundu. Önceki çalışmalarda bu işlem tüp bebek ve içinde vivo izleme üzerinde duruldu; Ancak, yalıtım gerçekten ters hücre elde, hangi anlayışımız apoptosis ters sonuçları üzerinde sınırlar henüz. Burada, biz bir Caspase-3/7 yeşil algılama boya aktif caspases ile etiket hücrelere apoptotik indüksiyon sonra yararlanın. Hücre pozitif sinyaller ile daha da floresan aktif hücre (FACS) kurtarma için sıralama sıralanır. Confocal mikroskobu altında morfolojik muayene apoptotik durumu FACS önce onaylamak yardımcı olur. Tumorigenicity bir artış kez yükselmesi kanser kök hücre (CSC) yüzdesi olarak bağlanabilir-tarihlerde hücreleri. Ayrıca, meme kanseri heterojen göz önüne alındığında, bu CSC benzeri hücreler kaynağını tanımlayan kanser tedavisi için kritik olacaktır. Böylece, meme kanseri olmayan kök hücreleri apoptosis uyarının harekete geçirilmesine karşılık, caspase aktive hücreleri izole ve Apoptozis ters işlemi yapmadan önce hazırlayın. Akış Sitometresi Analizi meme CSC benzeri hücreleri meme CSC benzeri hücreleri apoptosis ters sırasında Meme kanseri olmayan kök hücrelerden aktarıldığı gösteren tersine çevrilmiş grubunda yeniden görünmesini ortaya koymaktadır. Özet olarak, bu iletişim kuralı tarafından akış sitometresi apoptotik meme kanseri hücrelerinin yalıtım ve CSC yüzde ters işlem hücrelerdeki değişiklikler tespiti içerir.

Introduction

Kanser ülkeler dünya çapında1ağır yükü neden ölüm önde gelen nedenidir olmuştur. Meme kanseri görülme sıklığı ve mortalite açısından hem de kanser1her türlü arasında kadın hastalarda sık ve yaygın yüksek. Kanser heterojenite nedeniyle ilaçlar genellikle kemoterapi kanser hücre ölüm2,3,4elde etmek için kullanılır. Ortak kemoterapötik ilaçlar kez DNA5,6hedef, ancak, hızla büyüyen hücreler9, protein sentezi7,8 ve/veya Mikrotubul dynamics sırasında en etkilenirler durgun kanser kök hücre (CSC) s gibi genellikle daha az etkilenen10hücrelerdir. CSCs vardır, bu nedenle, daha büyük olasılıkla daha sonra neden ilaç direnci ve Kanser nüks10,11tedavi sonrası hayatta kalmak. Bu nedenle, CSCs ortadan kaldırılması kanser tedavisi için önemli bir konu haline gelmiştir ve CSCs kökeni incelenmesi gereklidir.

Apoptozis ters olgusu üzerinde daha fazla çalışmalar son on yılda12,13,14,15,da16,17,18 gerçekleştirilmiş , 19. bu kavramı ortaya çıkması daha önce bu yaygın olarak hücreleri geri dönüşümsüz caspase harekete geçirmek sonra apoptosis geçirecek kabul edildi. Caspases karmaşık apoptotik oluşumu ve aşağı akım yüzeylerde20bölünme gibi apoptozis, başlatma ve yürütme aşamaları kilit rolü oynamak protein enzimler bir aileyiz. Cellat caspases caspase 3 veya caspase 7 gibi aktivasyonu “dönüş yok” apoptoz21olarak kabul edilmiştir. Ancak, araştırmacılar son zamanlarda apoptosis ters tüp bebek her ikisi de oluşur ve sırasında hangi hücrelerin içinde vivo, hatta caspase harekete geçirmek ‘12den sonra,13,14 apoptosis kurtarabilirsiniz gözlenen , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Ayrıca, agresif özellikler daha yüksek direnç özgün apoptotik uyarıcı ve daha yüksek invasiveness algılanır tersine çevrilmiş kanser gibi hücreleri15. Bu nedenle, CSC benzeri hücre yüzdesi daha yüksek sonunda daha malign özellikleri apoptosis ters18sonra katkıda tedavi edilmezse hücrelere kıyasla tersine çevrilmiş nüfus olurdu önerilmiş.

Daha önce birçok çabaları vitro ve daha da önemlisi, apoptozis ters içinde vivo izlemek için büyük ölçüde bu işlemi16,17,19evrenselliğini teyit yardımcı yapılmıştır. Ancak, ters hücre sonuçlarını sistemik bir çalışma nedeniyle gerçekten apoptosis ters uğramıştır hücre yalıtım yetersiz bulunmuyor. Saf apoptotik hücreler almak ve yeniden elde etmek onları için daha fazla çalışma için bir ihtiyaç vardır. Bu sayede apoptosis için “dönüş yok”21 marker olarak geleneksel olarak iyi kabul edilen işaretçiyi cellat caspase etkinleştirme kullanın ve floresan aktif hücre (caspase-aktive hücreleri lekeli ayırımcılık FACS) sıralama kullanmak caspase-3/7 yeşil algılama boya ile. Boya kovalent bir kısa amino asit dizisi, tanınan ve 3/7 active caspases tarafından i ciddi DEVD bağlanır. Bölünme sitozol nerede DNA’yı bağlar ve güçlü floresans yayar çekirdeği translocate boya yayın yardımcı olur. Bu yordamı kullanarak bir toplu hücre nüfus içinde bazı hücreler apoptosis geçirmiş değil önler.

CSCs veya tümör başlatılıyor hücreleri tek bir kullanarak birçok solid tümör tespit edilen veya bir arada çeşitli yüzey marker(s) ve bu hücreler çok az sayıda form tümörler immünyetmezligi fareler22,23için yeterli, 24,25,26,27. CD44 ve CD24 sık meme CSC çalışmalar ve CD44 kullanılmıştır+/CD24– hücreleri meme CSCs26,27,28,29 tanımlanan , 30. son zamanlarda, biz apoptosis ters ve CSCs önerilen ilişkisi onaylamak ve tersine çevrilmiş meme kanseri hücreleri artan tümör şekillendirme yeteneği tüp bebek ve ile vivo kazandı göstermek için deneyler bir dizi gerçekleştirdiyseniz bir CSC işaretleri18hücrelerle yükseltilmiş yüzdesi. Her ne kadar biz değil hariç olasılığını meme CSCs daha iyi hayatta kalmak ve böylece apoptosis ters sonra tekrar ne zaman biz olmayan kök kanser hücreleri ve konu izole olduğunu da önemlisi, zenginleştirilmiş onları apoptosis tersine çevrilmesine, CSC başlangıçta olmayan kök içinde ortaya çıkacak olmayan kanser hücre nüfus, düşündüren kök kanser hücreleri apoptosis ters sırasında CSCs yüzdesi artışa katkıda bulunabilir.

Bu makalede apoptosis ters sonra meme CSC benzeri hücreleri meme kanseri olmayan kök hücreleri geçiş göstermek ve bu geçiş akış sitometresi tarafından tespit etmek için amaçlamaktadır. Meme kanseri olmayan kök hücreleri başlangıçta CD44 izole ederek hazır mısın–/CD24+ meme kanseri hücreleri FACS tarafından. O zaman, apoptozis indüklenen ve morfolojik değişiklikler, mikroskop altında doğruladı. Daha sonra apoptotik hücreler olumlu etiketli-Caspase 3/7 yeşil algılama boya tarafından FACS tarafından izole ve daha da apoptotik indükleyicileri apoptosis ters için yokluğunda kültürlü. Tersine çevrilen hücreleri CSC işaretleri ile akış sitometrik çözümlemesi için kurtarma 7 gün sonra lekeli. CD44 hücrelerle+/CD24 yeniden tersine çevrilmiş nüfus– işaretçileri görünür düşündüren CSC benzeri hücreleri olmayan kök kanser hücrelerinin geçiş apoptosis ters sırasında oluştu.

Apoptozis ters birden fazla kanseri gözlenen yanı sıra normal primer hücre hücre hatları ile in vitro12,13farklı apoptotik uyaranların tedavi. Bu işlem aynı zamanda Drosophila içinde takip edilmiştir içinde vivo16,17,19model. Temel mekanizma ile ilgili fazla bilgi Kanser nüks farklı kanser hastalığı modelleri ve CSCs kökeni bu el yazması açıklandığı gibi tekniği kullanılarak elde edilebilir.

Protocol

1. meme kanseri hücreleri kök hazırlanması Kültür MCF-7 ve 10 mL % 10 ısı inaktive fetal Sığır serum (FBS) 100 mm çanak ile takıma fenol red ücretsiz Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta hücrelerde MDA-MB-231. Kültür T47D fenol red-Alerjik RPMI 1640 Orta 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş 10 ml % 10 ısı-FBS ve % 1 v/v penisilin-streptomisin (PS) 100 mm çanak inaktive olur. Bir % 5 CO2/95% hava hücre kültür kuluçka 37 ° C’de kültür hücreleri.<b…

Representative Results

Kanser hücrelerinin CD44 ilk sıralama meme CSC benzeri hücreleri kök olmayan meme geçiş incelemek için-/CD24+ meme kanseri hücrelerinin ihtiyaç. MCF-7 hücre satırı için hangi yaklaşık %0.15 hücreler özgün nüfus (Şekil 1), bu adımı CSC imleçli CSC zenginleştirme apoptosis tersine çevirme sırasında olasılığını dışlamak yardımcı oldu. Hiçbir hücre özgün nüfus CSC imleçli olsaydı, tam tersine, gibi …

Discussion

Bu iletişim kuralı meme kanseri olmayan kök hücreleri geçiş meme CSC benzeri hücrelere apoptosis ters bir sonucu olarak algılamak için doğrudan ve net bir şekilde açıklar. Tersine çevrilen bu hücreler CSC özelliklerinin onay immünyetmezligi fareler18,24,26 benn in vitro mammosphere oluşumu tahlil ve in vivo xenograft nakli kullanarak yardımcı ,27,</su…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser yenilikçi teknoloji Fonu yenilik teknoloji Komisyonu tarafından desteklenen: finansman desteği devlet anahtar laboratuvar, Agrobiotechnology (CUHK), Lo Kwee-Seong Biyomedikal Araştırma Fonu ve Lee Hysan Vakfı. Y.X. CUHK üzerinden yüksek lisans öğrencilik tarafından desteklenmiştir.

Materials

MCF-7 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-22
MDA-MB-231 American Type Culture Collection (ATCC) HTB-26
T47D American Type Culture Collection (ATCC) HTB-133
Reagent
0.05% trypsin-EDTA Invitrogen 25300054
0.25% trypsin-EDTA Invitrogen 25200072
Alexa Fluor 680 annexin V conjugate Invitrogen A35109
bovine serum albumin USB 9048-46-8
CaCl2 · 2H2O Sigma-Aldrich C-5080
CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye Invitrogen C10423
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
Fc block Miltenyi Biotec 130-059-901
fetal bovine serum Invitrogen 16000044 heat-inactivated
HEPES USB 16926
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
L-glutamine Invitrogen 25030081
Mitotracker Red CMXRos Invitrogen M7512
monoclonal antibodies against human CD24 BD Biosciences 555428 PE Clone:ML5
Lot:5049759
RRID:AB_395822
monoclonal antibodies against human CD44 BD Biosciences 560531 PERCP-CY5.5 Clone:G44-26
Lot:7230770
RRID:AB_1727485
NaCl Sigma-Aldrich 31434
paclitaxel Sigma-Aldrich T7402
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control BD Biosciences 554648 Clone:G155-178 (RUO)
RRID:AB_395491
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15070-063
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control BD Biosciences 558304 Clone:27-35
RRID:AB_647257
phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific 21600010
propidium iodide Invitrogen P1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium Invitrogen 11835055 phenol red-free
sodium azide Sigma-Aldrich S2002
staurosporine Sigma-Aldrich S4400
Equipment
100 mm culture dish Greiner Bio-One 664160
12-well tissue culture plates Thermo Fisher Scientific 150628
Cell Strainer 40-μm nylon mesh BD Biosciences 08-771-1
FACSuite software bundle v1.0 BD Biosciences 651360
FACSVerse BD Biosciences 651155
FluoView FV1000 confocal microscope Olympus IX81 60X objective
FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b Olympus –
round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes BD Biosciences 352003
S3e sorter Bio-Rad 1451006
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
  2. Slamon, D. J., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).
  3. Geyer, C. E., et al. Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).
  4. Cameron, D., et al. A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses. Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).
  5. Liu, L. F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).
  6. Hertel, L. W., et al. Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2′,2′-difluoro-2′-deoxycytidine). Pesquisa do Câncer. 50 (14), 4417-4422 (1990).
  7. Ni, H., et al. Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis. British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).
  8. Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy. Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).
  9. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).
  10. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
  11. Pirozzi, G., et al. Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer. Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).
  14. Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis. Cancer Cell International. 13 (1), 63 (2013).
  15. Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).
  16. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Scientific Reports. 5, 9015 (2015).
  17. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  18. Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation. Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).
  19. Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  20. Li, J., Yuan, J. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).
  21. Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death. Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).
  22. Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Pesquisa do Câncer. 63 (18), 5821-5828 (2003).
  23. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
  24. O’Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
  25. Cioffi, M., et al. Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer. Scientific Reports. 5, 10357 (2015).
  26. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  27. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Pesquisa do Câncer. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  28. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).
  29. Sheridan, C., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast Cancer Research. 8 (5), R59 (2006).
  30. Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation. Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).
  31. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).
  32. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  33. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).
  34. Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).
  35. Saunders, D. E., et al. Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells. International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).
  36. Miller, A. V., et al. Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor. PLoS One. 8 (4), e60685 (2013).
  37. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  38. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
  39. Ng, S. Y., et al. Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).
  40. Lo, I. C., et al. TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).
  41. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).
  42. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  43. Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).
  44. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  45. Desiderio, V., et al. Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells. Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).
  46. Gupta, P. B., et al. Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells. Cell. 146 (4), 633-644 (2011).

Tags

Flow CytometryBreast CancerStem CellsApoptosis ReversalCell IsolationCell CultureCell SortingCD44CD24Trypsin-EDTAFACS BufferFc Block
check_url/pt/58642?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Xu, Y., So, C., Lam, H., Fung, M., Tsang, S. Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal. J. Vis. Exp. (143), e58642, doi:10.3791/58642 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image