Estabelecimento do modelo humanizado duplo do rato de TK-NOG para a patogénese HIV-associada do fígado
Summary
Este protocolo fornece um método confiável para estabelecer camundongos humanizados com o sistema imunológico humano e células hepáticas. Os ratos imunodeficientes reconstituídos duplos conseguidos através da injeção pseudoaneurysms de hepatócitos humanos e de pilhas de haste hematopoietic de CD34+ são suscetíveis à infecção do vírus-1 da imunodeficiência humana e recapitulam dano de fígado como observado em Doentes infectados pelo VIH.
Abstract
Apesar da expectativa de vida aumentada dos pacientes contaminados com o vírus de imunodeficiência humana-1 (HIV-1), a doença de fígado emergiu como uma causa comum de sua morbosidade. A Imunopatologia hepática causada pelo HIV-1 permanece elusiva. Os modelos animais pequenos do xenograft com hepatócitos humanos e o sistema imunitário humano podem recapitular a biologia humana da patogénese da doença. Nisto, um protocolo é descrito para estabelecer um modelo humanizado duplo do rato com os hepatócitos humanos e o transplante de CD34+ hematopoietic/pilhas do progenitor (hspcs), para estudar a Imunopatologia do fígado como observado em pacientes HIV-contaminados. Para conseguir a reconstituição dupla, o macho TK-NOG (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Sug TG (ALB-tk) 7-2/shijic) os camundongos são injetados intraperitonealmente com doses de ganciclovir (GCV) para eliminar as células hepáticas transgênicas do camundongo, e com treosulfano para condicionamento não mieloablativo, ambos facilitar o desenvolvimento de hepatócitos humanos (HEP) e do sistema imunológico humano (HIS). Os níveis da albumina humana (ALB) são avaliados para o Engraftment do fígado, e a presença de pilhas imunes humanas no sangue detectado pela citometria do fluxo confirma o estabelecimento do sistema imunitário humano. O modelo desenvolvido utilizando o protocolo aqui descrito assemelha-se a múltiplos componentes de lesão hepática por infecção pelo HIV-1. Seu estabelecimento poderia revelar-se essencial para estudos da co-infecção do vírus de hepatite e para a avaliação de antivirais e de drogas antiretroviral.
Introduction
Desde o advento da terapia antirretroviral, houve uma diminuição substancial nos óbitos relacionados à monoinfecção pelo HIV-1. Noentanto, adoença hepática surgiu como uma causa comum de morbidade em pacientes infectados pelo HIV1,2. Coinfecções de vírus da hepatite com infecção pelo HIV-1 são mais comuns, representando 10%-30% das pessoas infectadas pelo HIV nos Estados Unidos3,4,5.
A especificidade do hospedeiro do HIV-1 e dos vírus da hepatite limita a utilidade de pequenos modelos animais para estudar doenças infecciosas específicas do homem ou para investigar múltiplos aspectos da patogênese hepática associada ao HIV-1. Camundongos imunodeficientes que permitem o Engraftment de células humanas e/ou tecidos (denominados modelos humanizados do camundongo) são modelos animais aceitáveis para estudos pré-clínicos6,7,8. Desde a introdução de camundongos humanizados no início dos anos 2000, vários estudos pré-clínicos de toxicidade hepática humana colestática, patógenos específicos do homem, incluindo HIV-1 e distúrbios neurocognitivos associados ao HIV, vírus Epstein Barr, hepatite e outros doençasinfecciosas, foraminvestigadas nesses camundongos6,9,10,11. Os modelos múltiplos do rato para CD34+ hspcs e/ou a transplantação humana do hepatócito têm sido desenvolvidos por muito tempo e melhoraram sobre o tempo para estudar a patogénese da doença do vírus de hepatite B (HBV)-doença de fígado associada12, 13 anos de , 14. vários modelos para hspc e hepatócitos humanos (HEP) transplante são baseados em cepas, conhecido como Nog (Nod. CG-prkdcscid Il2rgtm1Sug/jictac)8,13, NSG (Nod. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj)15, Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2TM 1.1 FLV Il2rgTM 1.1 FLV/j)12, e Fah-/- Nod rag1-/- il2rγnull mouse16. No entanto, cada modelo tem suas próprias vantagens e limitações; por exemplo, AFC8 camundongos humanizados duplos para HEPs e células-tronco humanas (HSCs) em um Balb/C-Rag2-/- γc-/- background permite o bem sucedido Engraftment de células imunes e hscs, mas há uma ausência de um antígeno-específico T-e B-Cell resposta neste modelo12. As principais preocupações em reconstituir camundongos humanizados duplos incluem o Engraftment suboptimal, a falta de modelos adequados para suportar diferentes tecidos, condições incompatíveis, rejeição imune, ou doença do enxertocontrao hospedeiro (DECH), e técnicas dificuldades, como manipulações de risco com recém-nascidos e altas taxas de mortalidade devido a anormalidades metabólicas13.
Embora os camundongos humanizados tenham sido usados para a pesquisa por HIV há muitos anos17,18,19, o uso de camundongos humanizados para estudar os danos hepáticos causados pelo HIV-1 tem sido limitado20. Nós relatamos previamente o estabelecimento de um modelo humanizado duplo do rato de TK-NOG e de sua aplicação na doença de fígado HIV-associada8. Este modelo mostra o Engraftment robusto do fígado e das pilhas imunes e recapitula a patogénese da infecção do HIV. Esta discussão apresenta um protocolo detalhado, incluindo os passos mais críticos no transplante de hepatócitos humanos. Uma descrição dos HSPCs exigidos para um Engraftment bem sucedido dos HEPs e o estabelecimento de um sistema imune funcional em ratos de TK-NOG é apresentada igualmente. O uso destes ratos para estudar o imunopatogênese HIV-associado do fígado é detalhado. Os ratos masculinos de TK-Nog que carreg um tipo fígado-específico do vírus de palavra simples de herpes-1 transgene da quinase do timidina (HSV-tk) são usados. As células hepáticas do rato que expressam este transgene podem ser facilmente abladas após uma breve exposição a uma dose não tóxica de GCV. As pilhas de fígado humanas transplantadas são mantidas estàvel dentro do fígado do rato sem medicina exógena21. Os camundongos também são pré-condicionados com doses nonmyeloablative de treosulfan para criar um nicho na medula óssea do rato para células humanas8. Os camundongos imunodeficientes TK-NOG são injetados intrasplenicamente com HEPs e HSPCs multipotentes. Os ratos são monitorados regularmente para a reconstituição do sangue e do fígado pelo imunofenotipagem do sangue e pelas medidas de níveis da humano-albumina do soro, respectivamente. Camundongos com uma reconstituição bem-sucedida de mais de 15% para ambas as células imunes humanas e HEPs são injetados intraperitonealmente com HIV-1. O efeito do HIV no fígado pode ser avaliado tão cedo quanto 4-5 semanas pós-infecção. É importante notar que, porque o HIV-1 é usado, todas as precauções necessárias devem ser tomadas durante o manuseio do vírus e injetá-lo em camundongos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O fígado está comprometido e danificado em pacientes infectados pelo HIV24. Modelos experimentais de animais pequenos para o estudo de doenças hepáticas humanas na presença de HIV-1 é extremamente limitado, apesar da disponibilidade de alguns modelos animais cotransplantados com CD34+ hspcs e hepatócitos7,12, a 25. Em experimentos in vitro, os hepatócitos são mostrados para ter infecç…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de saúde conceder R24OD018546 (para L.Y.P. e SG). Os autores gostariam de agradecer a Weizhe li, Ph.D., pela ajuda em procedimentos cirúrgicos, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng para imunohistologia, membros da unidade de pesquisa de citometria de fluxo da UNMC diretor Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S., e Samantha Wall, B.S., UNMC avançada microscopia membros do núcleo da instalação Janice A. Taylor, B.S., e James R. talaska, B.S., para o apoio técnico. Os autores reconhecem os Drs. Mamoru Ito e Hiroshi Suemizu da CIEA por fornecerem camundongos TK-NOG e o Dr. Joachim Baumgart por fornecerem treosulfan. Os autores agradecem ao Dr. Adrian Koesters, UNMC, por sua contribuição editorial para o manuscrito.
Materials
| 27G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
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