Dit protocol beschrijft een gedetailleerde workflow voor de generatie en ex vivo karakterisering van oncolytische virussen voor expressie van immunomodulators, met behulp van mazelen virussen bispecifieke T cel engagers codering als een voorbeeld. Toepassing en aanpassing aan andere vector platforms en transgenen zal de ontwikkeling van nieuwe immunovirotherapeutics voor klinische vertaling versnellen.
Succesvolle kanker immunotherapie heeft het potentieel om op lange termijn tumor controle. Ondanks recente klinische successen blijft er een dringende behoefte aan veilige en effectieve therapieën die zijn toegesneden op individuele tumor immuun profielen. Oncolytische virussen kunnen de inductie van anti-tumor immuunresponsen evenals tumor-beperkte genexpressie. Dit protocol beschrijft de generatie en ex vivo analyse van immunomodulerende oncolytische vectoren. Focussen op mazelen vaccin virussen bispecifieke T cel engagers codering als een voorbeeld, kan de algemene methodologie worden aangepast aan andere soorten van het virus en de transgenen. De gepresenteerde workflow omvat het ontwerp, klonen, redding en verspreiding van recombinante virussen. Testen om replicatie kinetiek en lytische activiteit van de vector en de functionaliteit van de geïsoleerde immunomodulator ex vivo te analyseren zijn opgenomen, waardoor de generatie van nieuwe agenten voor de verdere ontwikkeling in preklinische modellen en uiteindelijk klinische vertaling.
Oncolytische virussen (OVs) worden ontwikkeld als anti-kanker therapieën die specifiek repliceren binnen en doden tumorcellen terwijl gezonde weefsels intact blijven. Het is inmiddels gemeenschappelijk begrip dat oncolytische een (Overurentar), in de meeste gevallen, niet afhankelijk is van de lysis van de volledige tumor uitsluitend door efficiënte replicatie en verspreiding van het virus, maar vergt extra mechanismen van actie voor de behandeling succes, met inbegrip van vasculaire en stromale targeting en, belangrijker, immuun stimulatie1,,2,,3,4. Terwijl vele vroege OV studies ongewijzigde virussen gebruikt, heeft huidige onderzoek geprofiteerd van een verbeterde biologische begrip, virus biobanken die potentieel bevatten roman OVs, en de mogelijkheden aangeboden door genetische manipulatie om te maken van geavanceerde OV platformen5,6,7.
Gezien het recente succes van immunotherapie, zijn immunomodulerende transgenen van bijzonder belang met betrekking tot de genetische modificatie van OVs. Gerichte uitdrukking van dergelijke genproducten door OV-geïnfecteerde tumorcellen vermindert toxiciteit in vergelijking met systemische toediening. Gericht op wordt bereikt met behulp van virussen met inherente oncoselectivity of door aanpassing van virale tropisme8. Lokale immunomodulatie verbetert de veelzijdige anti-tumor mechanismen van Overurentar. Bovendien is deze strategie instrumenteel in het ondervragen van de wisselwerking tussen virussen, tumorcellen, en het immuunsysteem van de gastheer. Dit protocol biedt daartoe een toepasselijke en instelbare workflow te ontwerpen, kloon, redden, propageren, en valideren van oncolytische paramyxovirus (specifiek Mazelenvirus) vectoren codering van dergelijke transgenen.
Modulatie van de immuunrespons kan worden bereikt door een breed scala aan transgenic producten gericht op de verschillende stappen van de kanker-immuniteit cyclus9, waaronder verbetering van de tumor antigeen erkenning [bv. tumor-geassocieerde antigenen (TAAs) of inductoren van grote histocompatibility complex (MHC) klasse I moleculen] over ondersteuning van dendritische cel rijping voor efficiënte antigeen presentatie (cytokines); werven en activeren van gewenste immune cellen zoals cytotoxische en helper T cellen [chemokines, bispecifieke T cel engagers (BTEs)]; gericht op onderdrukkende cellen zoals regulatoire T-cellen, suppressor myeloïde-afgeleide cellen, tumor-geassocieerde macrofagen en fibroblasten kanker-geassocieerde (antilichamen, BTEs, cytokines); en het voorkomen van effector cel inhibitie en uitputting (checkpoint-remmers). Een overvloed aan biologische agentia is dus beschikbaar. Evaluatie van dergelijke immunomodulators virus-gecodeerd met betrekking tot de therapeutische werking en mogelijke synergie, evenals het begrip van de respectieve mechanismen is nodig ter verbetering van kankertherapie.
Negatieve zin single-stranded RNA virussen uit de familie van de Paramyxoviridae worden gekenmerkt door verschillende functies dat bevorderlijk is voor hun gebruik als oncolytische vectoren. Het gaat hierbij om een natuurlijke oncotropism, grote genomic capaciteit voor transgenen (meer dan 5 kb)10,11, efficiënte verspreiding met inbegrip van de vorming van syncytia en hoge immunogeniciteit12. Daarom OV platformen op basis van canine distemper virus13, bof virus14, Newcastle disease virus15, Sendai virus16,17, simian virus 518en Tupaia paramyxovirus19 zijn ontwikkeld. Meest prominent, levende verzwakte mazelen virus vaccin stammen (MV) vorderingen preklinische en klinische ontwikkeling20,21 gemaakt hebben. Deze virusstammen zijn gebruikt voor decennia voor routinematige immunisatie met een uitstekende veiligheid record22. Bovendien is er geen risico voor dat mutagenese als gevolg van de strikt cytosolische replicatie van paramyxovirussen. Een veelzijdige omgekeerde genetica-systeem op basis van anti-genomic cDNA dat voorziet in de invoeging van transgenen in extra transcriptie eenheden (ATUs) is beschikbaar11,23,24. MV vectoren Natriumjodide symporter (MV-NOS) codering voor beeldvorming en radiotherapie of oplosbare carcino antigeen (MV-CEA) als een surrogaat marker voor virale genexpressie zijn momenteel geëvalueerd in klinische proeven (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 en NCT00408590). Veilige beheer is bevestigd en gevallen van anti-tumor werkzaamheid hebben gemeld in vorige studies25,26,27,28,29, 30 (herzien door Msaouel et al.31), de weg vrijmaakt voor extra oncolytische mazelen virussen die zijn ontwikkeld en getest preclinically. MV immunomodulerende moleculen gericht op de verschillende stappen van de cyclus voor kanker-immuniteit is aangetoond dat de vertraging van de tumorgroei en/of verlengen van overleven in muizen, met bewijs voor immuun-gemedieerde werkzaamheid en lange-termijn beschermende immuun geheugen in syngeneic codering Muismodellen. Vector-gecodeerde transgenen omvatten granulocyt-macrofaag kolonie stimulerende factor (GM-CSF)32,33, H. pylori neutrofiele-activeren eiwit34, immuun checkpoint remmers35, interleukine-12 (IL-12)36, TAAs37BTEs38, die een tumor cross-link oppervlakte-antigeen met CD3 en dus induceren anti-tumor activiteit door polyklonale T-cellen, ongeacht de T cel receptor specificiteit en co-stimulatie ( Figuur 1). De veelbelovende preklinische resultaten voor deze constructies vraag verder translationeel inspanningen.
Talimogene laherparepvec (T-VEC), een type ik herpes simplexvirus GM-CSF, codering is de enige oncolytische therapeutische goedgekeurd door de Amerikaanse Food en Drug Administration (FDA) and Europese geneesmiddelen Agentschap (EMA). De fase III studie leidt tot goedkeuringen in eind 2015 heeft alleen geen werkzaamheid op de site van intra-tumoral injectie, maar ook abscopal effecten (dwz, remissies van niet-geïnjecteerde laesies) in geavanceerde melanoom39getoond. T-VEC gekomen sindsdien bijkomende proeven voor toepassing in andere entiteiten van de tumor (bijvoorbeeld, niet-melanoom huidkanker, NCT03458117, alvleesklierkanker, NCT03086642) en voor de evaluatie van combinatie therapieën, vooral met immuun checkpoint remmers (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 en Ribas et al.40).
Hieruit blijkt dat niet alleen het potentieel van oncolytische immunotherapie, maar ook de noodzaak van verder onderzoek om te identificeren van superieure combinaties van Overurentar en immunomodulatie. Rationeel ontwerp van aanvullende vectoren en hun ontwikkeling voor preklinische testen is de sleutel tot deze onderneming. Dit zal ook verder inzicht in de onderliggende mechanismen en gevolgen heeft voor de progressie naar meer gepersonaliseerde behandeling van kanker. Te dien einde presenteert deze publicatie de methodologie voor de wijziging en de ontwikkeling van paramyxovirussen voor gerichte kanker immunotherapie en, meer in het bijzonder, oncolytische mazelen virussen codering van T-cel-boeiende antilichamen (Figuur 2).
Oncolytische immunotherapie (dwz., Overurentar in combinatie met immunomodulatie) houdt grote belofte voor de behandeling van kanker, veeleisende verdere ontwikkeling en optimalisatie van oncolytische virussen codering immunomodulerende eiwitten. Dit protocol wordt beschreven methoden om te genereren en valideren van dergelijke vectoren voor het daaropvolgende testen in relevante preklinische modellen en potentiële toekomstige klinische traduction roman anti-kanker therapieën.
Talri…
The authors have nothing to disclose.
Deze methoden werden opgericht in de een groep geleid door Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts aan het National Center for Tumor ziekten in Heidelberg. We zijn dank verschuldigd aan hem en alle leden van het team van het laboratorium, met name Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler, en Jessica Albert. Dit werk werd gesteund door de anders Kröner-Fresenius-Stiftung (Grant 2015_A78 aan C.E. Engeland) en de Duitse National Science Foundation (DFG, nl 1119/2-1 toekennen C.E. Engeland). J.P.W. Heidbuechel ontvangt een toelage van de Helmholtz International Graduate School for Cancer Research.
Rapid DNA Dephos & Ligation Kit | Roche Life Science, Mannheim, Germany | 4898117001 | |
CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | K1231 | |
Agarose | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A9539-500G | |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN, Hilden, Germany | 28704 | |
NEB 10-beta Competent E. coli | New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany | C3019I | |
LB medium after Lennox | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X964.1 | |
Ampicillin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HP62.1 | |
QIAquick Miniprep Kit | QIAGEN, Hilden, Germany | 27104 | |
Restriction enzyme HindIII-HF | New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany | R3104S | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 31966-021 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biosera, Boussens, France | FB-1280/500 | |
FugeneHD | Promega, Mannheim, Germany | E2311 | may be replaced by transfection reagent of choice |
Kanamycin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | K0129 | |
Vero cells | ATCC, Manassas, VA, USA | CCL81 | |
B16-CD46/ B16-CD20-CD46 | J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg | available upon request | |
Granta-519 | DSMZ, Braunschweig, Germany | ACC 342 | |
Opti-MEM (serum-free medium) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany | 31985070 | |
Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT) | PromoKine, Heidelberg, Germany | PK-CA20-300-1000 | includes XTT reagent |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany | 14190-094 | |
QIAquick Ni-NTA Spin Columns | QIAGEN, Hilden, Germany | 31014 | |
Sodium chloride | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.3 | |
Imidazole | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | I5513-25G | |
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | Merck, Darmstadt, Germany | UFC901024 | |
BCA Protein Assay Kit | Merck Milipore | 71285-3 | |
IgG from human serum | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | I4506 | |
Anti-HA-PE | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-257 | RRID: AB_871939 |
Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 555749 | RRID: AB_396091 |
Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10 | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 12158167001 | RRID: AB_390915 |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-090-485 | |
MS Columns | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-102 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
RIPA buffer | Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA | MB-030-0050 | |
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega, Mannheim, Germany | G1780 | includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution |
Cell lifter | Corning, Reynosa, Mexico | 3008 | |
10 cm dishes | Corning, Oneonta, NY, USA | 430167 | |
15 cm dishes | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 639160 | |
96-well plates, U-bottom | TPP, Trasadingen, Switzerland | 92097 | |
96-well plates, flat bottom | Neolab, Heidelberg, Germany | 353072 | |
6-well plates | Neolab, Heidelberg, Germany | 353046 | |
12-well plates | Neolab, Heidelberg, Germany | 353043 | |
50 mL tubes | nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany | 02-572-3001 | |
T175 cell culture flasks | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | 159910 | |
0.22 µm filters | Merck, Darmstadt, Germany | SLGPM33RS |