استخدام النظم الآلية للعملية وتضمين Colonic موريني عينات لإجراء تحاليل نسيجية
Summary
الافتقار إلى التوحيد القياسي لتجهيز الأنسجة موريني يقلل نوعية التحليل نسيجية موريني مقارنة بالعينات البشرية. نقدم هنا، وضع بروتوكول لتنفيذ دراسة نسيجية مورين الأنسجة colonic ملتهبة وأونينفلاميد لإظهار جدوى نظم الروبوتية المستخدمة بصورة روتينية لتجهيز وتضمينها العينات البشرية.
Abstract
فهم الأمراض البشرية قد اتسع إلى حد كبير بفضل دراسة نماذج حيوانية. ومع ذلك، يلزم نسيجية تقييم نماذج تجريبية دقيق الذي طبق للعينات البشرية. في الواقع، استخلاص نتائج موثوق بها ودقيقة حاسمة تتأثر بنوعية إعداد قسم الأنسجة. هنا، نحن وصف بروتوكول نسيجية تحليل الأنسجة موريني الذي يقوم بتنفيذ عدة خطوات الآلي أثناء الإجراء، من إعداد أولية لتضمين البارافين العينات موريني. يسهم في الحد المتغيرات المنهجية من خلال توحيد بروتوكول صارم من إجراءات التشغيل الآلي إلى زيادة الموثوقية العام للتحليل الباثولوجي مورين. على وجه التحديد، يصف استخدام التجهيز الآلي لهذا البروتوكول وتضمين أنظمة روبوتية، المستخدمة بشكل روتيني لمعالجة الأنسجة وتضمين البارافين العينات البشرية، لمعالجة العينات مورين من التهاب الأمعاء. نخلص إلى أن موثوقية نسيجية فحص الأنسجة مورين هو زيادة كبيرة عند إدخال تقنيات موحدة ومؤتمته.
Introduction
في العقود الأخيرة، وضعت عدة نماذج تجريبية لتشريح الآليات المسببة للأمراض المؤدية إلى الأمراض البشرية1،2. من أجل تقييم مدى خطورة المرض، يجب تقييم تأثير العلاج الباحثين ودراسة الاختلافات المعمارية الخلوية وغذائها أو مقدار التهاب3. هناك حاجة لتنفيذ تلك النماذج التجريبية، تحليلاً مفصلاً نسيجية، غالباً ما مقارنة العينات مورين والبشرية4،5.
بالإضافة إلى ذلك، عادة تجهيز العينات البشرية وسجل بالمرافق الأساسية التشريح المرضى والباثولوجيا البشرية ذوي الخبرة من خلال معايير نسيجية وأساليب موحدة. على العكس من ذلك، الأنسجة موريني هي عادة ثابتة والمضمنة وتحليلها من قبل الباحثين ذوي الخبرة المحدودة للبروتوكولات نسيجية. نوعية وموثوقية لدراسة نسيجية يبدأ بإعداد أقسام الأنسجة عالية الجودة. هناك عدة عوامل تساهم حاسمة في زيادة أو انخفاض نوعية التحليل النهائي، بما في ذلك التثبيت، العيانية تمزيقها، والتجهيز، البارافين التضمين، والتضمين من عينات6،7.
وتخضع جميع هذه المقاطع التي تنطوي على التلاعب بالعينة الأخطاء اليدوية، بما في ذلك الدمج اليدوي للعينات، وإلى حد أقل، مبضع اليدوي تمزيقها وتلطيخ. في الوقت الحاضر، تعتمد العملية برمتها من إعداد الأنسجة مورين للتقييم النسيجي على البروتوكولات التي تختلف من مختبر إلى مختبر والبروتوكولات اليدوي. والهدف من هذه الدراسة لتنفيذ بروتوكولات موحدة الآلي لتقليل الأخطاء وتقلبه في دراسة نسيجية موريني.
على حد علمنا، يصف لنا هنا البروتوكولات الأولى للأنسجة مؤتمتة بالكامل تجهيز وتضمينها للتقييم النسيجي للأنسجة مورين؛ هذه تستخدم بشكل روتيني في وحدات علم الأمراض لتحليل العينات البشرية. كمثال عملي لجدوى هذه الطريقة، نموذج موريني من التهاب الأمعاء قد تم تحليلها، أي,، النموذجي التهاب القولون المزمن الناجم عن الإدارة المتكررة من كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS) في مياه الشرب8 ،9. هذا الإعداد التجريبية عن كثب يشبه التهاب الأمعاء البشرية من الأمراض (بنك التنمية بين الأمريكتين)10 منذ DSS معاملة الحيوانات يحمل علامات التهاب الأمعاء، مثلاً، فقدان الوزن، البراز فضفاضة أو الإسهال، وتقصير القولون وكذلك التليف 89،،11. كما لاحظ للبشرية بنك التنمية بين الأمريكتين المرضى، يولد العلاج مفاجآت دورة مرض معقدة. في هذا السياق، يلزم وضع تقييمات النسيجي فهم التغيير العميق لهندسة الأنسجة. وبالتالي، تنفيذ البروتوكولات وصف لزيادة جودة إعداد عينة قد تفيد الباحثين الاعتماد على تفسير النسيجي والمناعي ويحلل لإعدادات التجريبية موريني. مورين نماذج تجريبية من الأمراض البشرية التي تنطوي على التعديلات لهندسة الأنسجة، وجود ارتشاح النسيج الخلوي أو التهاب في مختلف الأنسجة والأعضاء (الأمعاء، المخ، الكبد، الجلد) يمكن استخدام زيادة نوعية إعداد نموذج لدراسة نسيجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
فنحن نستخدم مختلف الخطوات الآلي أثناء إعداد الأنسجة مورين لتحليل الأنسجة. ويهدف هذا البروتوكول توفير تلميحات التقنية لزيادة في إمكانية تكرار نتائج والتوحيد للعملية برمتها، ومن ثم تعزيز الجودة الشاملة للتقييم النهائي نسيجية. قمنا بتنفيذ الصكوك الآلي وأساليب الإعداد والتضمين من الأنسجة?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر إدارة علم الأمراض من مستشفى Policlinico إيرككس وميلانو للدعم التقني ومرفق IEO الحيوان للمساعدة في تربية الحيوانات.
Materials
| Absolute Ethanol anhydrous | Carlo Erba | 414605 | reagent |
| Absolute ETOH | Honeywell | 02860-1L | reagent |
| Aluminium Potassium Sulfate | SIGMA | A6435 | reagent |
| Aniline Blue | SIGMA | 415049 | reagent |
| carbol Fuchsin | SIGMA | C4165 | reagent |
| CD11b (clone M1/70) | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | antibody |
| CD20 IHC (clone SA275A11) | Biolegend | 150403 | antibody |
| CD3 (17A2) | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | antibody |
| CD4 (GK1.5) | BD Biosciences | 552051 | antibody |
| CD45.2 (clone 104) | BioLegend | 109837 | antibody |
| CD8 (53-6.7) | BD Biosciences | 553031 | antibody |
| Citrate Buffer pH 6 10X | SIGMA | C9999 | reagent |
| Dab | Vector Laboratories | SK-4100 | reagent |
| DPBS 1X | Microgem | L0615-500 | reagent |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | reagent |
| EDTA | SIGMA | E9884 | reagent |
| EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex Substrate | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ Rat Linker | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| Eosin | VWR | 1.09844 | reagent |
| F4/80 (clone BM8) | BioLegend | 123108 | antibody |
| Formalin | PanReac | 2,529,311,215 | reagent |
| glacial acetic acid | SIGMA | 71251 | reagent |
| Goat-anti-Rat-HRP | Agilent DAKO | P0448 | antibody |
| Haematoxylin | DIAPATH | C0303 | reagent |
| LEICA Rotary microtome (RM2255) | Leica | RM2255 | equipment |
| Ly6g (clone 1A8) | BD Biosciences | 551459 | antibody |
| Mercury II Oxide | SIGMA | 203793 | reagent |
| Omnis Clearify Clearing Agent | DAKO | CACLEGAL | reagent |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | reagent |
| Orange G | SIGMA | O3756 | reagent |
| Paraffin | Sakura | 7052 | reagent |
| Peloris | LEICA | equipment | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | reagent |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Microgem | L0501-500 | reagent |
| STS020 | Leica | equipment | |
| Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette | SAKURA | 7022 | equipment |
| Tissue-Tek Automated paraffin embedder | Sakura | equipment | |
| Xylene | J.T.Baker | 8080.1000 | reagent |
Referências
- Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
- Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
- Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
- Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Peters, S. R. . A Practical Guide to Frozen Section Technique. , (2010).
- Rosai, J. . Rosai and Ackerman’s Surgical Pathology. , (2011).
- Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
- Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).
