عزل، وتسلسلها، وتحليل MicroRNAs خارج الخلية من الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة
Summary
هذا البروتوكول يوضح كيفية تنقية microRNAs خارج الخلية من خلية ثقافة وسائل الإعلام لبناء مكتبة رنا الصغيرة وتسلسل الجيل القادم. مختلف نقاط التفتيش لمراقبة الجودة ويرد وصف للسماح للقراء لفهم ما يمكن توقعه عند العمل مع نماذج الإدخال المنخفضة مثل اكسرناس.
Abstract
الكشف خارج الخلية وتعميم (اكسرنا) يتم إنتاجها بواسطة العديد من أنواع الخلايا في الجسم وتوجد في العديد من سوائل الجسم مثل اللعاب والبلازما والمصل، والحليب والبول. هي واحدة من مجموعة فرعية من هذه الكشف المنظمين بوسترانسكريبشونال – ميكرورناس (ميرناس). لتحديد ميرناس تنتجها أنواع محددة من الخلايا، يمكن استخدام نظم الاستزراع في المختبر للحصاد، واكسرناس الشخصية المستمدة من مجموعة فرعية واحدة من الخلايا. العوامل يفرز من الخلايا الجذعية الوسيطة متورطون في التخفيف من العديد من الأمراض، ويستخدم كالنظام النموذجي في المختبر هنا. وتصف هذه الورقة عملية جمع، وتنقية من الحمض النووي الريبي الصغيرة وتوليد المكتبة إلى تسلسل ميرناس خارج الخلية. اكسرناس من وسائط الثقافة تختلف عن الحمض النووي الريبي الخلوية كونها منخفضة عينات من الحمض النووي الريبي الإدخال، الذي يدعو إلى إجراءات محسنة. يوفر هذا البروتوكول دليل شامل للتسلسل اكسرنا صغيرة من وسائط الثقافة، تظهر نقاط التفتيش لمراقبة الجودة في كل خطوة أثناء تنقية اكسرنا وتسلسلها.
Introduction
خارج الخلية وتعميم الكشف (اكسرناس) موجودة في سوائل الجسم المختلفة وهي مقاومة نحو رنسيس1،2. وفرة عالية، واستقرارها وسهولة الوصول بشكل جذاب للتقييم السريري كعلامات التشخيص وتنبؤاتها3. واسطة النقل اكسرناس وتشمل حويصلات خارج الخلية (EVs)، رابطة مع البروتينات الدهنية (مثل البروتين الدهني الكثافة؛ الحميد) ومجمعات ريبونوكليوبروتين (مثل مع مجمعات Argonaute2)4.
هي مجموعة فرعية اكسرناس ميكرورناس (ميرناس)، وصغيرة غير الترميز الكشف من حوالي 22 nt التي تنظم التعبير الجيني بوسترانسكريبشونال. ميرناس السابقين قد تورطت في خلية خلية الاتصال وتنظيم التوازن الخلية5. على سبيل المثال، يسلم الحميد السابقين-مير-223 إلى خلايا بطانية لقمع جزيء الالتصاق بين الخلايا 1 (ICAM-1) والتهاب6. من المثير للاهتمام، كما يعتبر المنقولة من حويصلات خارج الخلية من الكريات البيضاء إلى خلايا سرطان الرئة، برمجة إليها اتخاذ على النمط الظاهري أكثر الغازية7مير-223. وهكذا، الترنسكربيتوم ميرناس السابقين من مختلف سوائل الجسم وخلية الثقافة المتوسطة سوف تحسن كثيرا من فهمنا لإشارات السابقين-ميرنا.
الجيش الملكي النيبالي الصغيرة تسلسل (seq رنا الصغيرة) هو أداة قوية يمكن استخدامها لفهم ترانسكريبتوميكس الكشف الصغيرة. ويمكن مقارنة عينات مختلفة بين الكشف عن خلطات المعروفة، بل يمكن أيضا الكشف عن رواية الكشف الصغيرة وتتميز. ونتيجة لذلك، كما أنها وسيلة قوية لتحديد ميرناس أعرب عن خلطات تحت ظروف مختلفة. واحدة من عقبات تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة غير أن الصعوبة في توليد مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة من السوائل اكسرنا منخفضة المدخلات مثل السوائل المخية، اللعاب، البول، والحليب، والمصل ووسائل الإعلام الثقافة. يتطلب البروتوكول “تراسك الصغيرة رنا المكتبة الإعدادية” من إيلومينا تقريبا 1 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي إجمالي جودة عالية ويتطلب البروتوكول “نيبنيكست الصغيرة رنا المكتبة الإعدادية مجموعة” من نيو إنجلاند Biolabs 100 ميكروغرام 1 نانوغرام من الجيش النيبالي الملكي8،9. وفي أحيان كثيرة، مجموع الجيش الملكي النيبالي من هذه العينات الكشف عن الحد الأدنى للتقليدية تجاه الأشعة فوق البنفسجية الطيفية.
السابقين-ميرناس المستمدة من سوائل الجسم علامات تشخيصية والتشخيص يحتمل أن تكون جيدة. بيد من أجل دراسة الآثار الفنية أو لتحديد منشأ محددة السابقين-ميرناس، خلية ثقافة النظم غالباً ما تستخدم بدلاً من ذلك. وقد درست الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) على نطاق واسع لأن تلك المركبات قد تورطت في التخفيف من كثير من الأمراض بما في ذلك احتشاء عضلة القلب ومرض الزهايمر والابتزاز مقابل المرض المضيف10. هنا، نحن إظهار تنقية ميرناس السابقين من MSCs المشتقة من نخاع العظام (بمسكس) والخطوات المحددة المستخدمة لتحسين البناء مكتبة رنا الصغيرة وتسلسل وتحليل البيانات (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتسلسل الجيل القادم من اكسرناس التي تمكن من تحليل التعبير التفاضلية من العينات المدخلات المنخفضة. الانضمام إلى بروتوكول معين لعزل EV واكسرنا مهم لأن التعديلات حتى الصغيرة (أي خطوة تنبيذ فائق أو تغيير نوع الدوار) يمكن أن تؤثر الترنسكربيتوم وميرنا المستويات<sup class="xre…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون للسيد كلاوس الحافلة والسيدة ريتا Rosendahl في إينانو الخاصة بالمساعدة التقنية. شكر خاص إلى الدكتور دانييل أوتزين للسماح لنا الاستخدام المتكرر لبلده أولتراسينتريفوجي. وأيد هذه الدراسة أن الدانمرك “صندوق الابتكار” (حشد المشروع).
Materials
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol – used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
Referências
- Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).
- Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184 (2013).
- Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs – an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
- Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
- Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
- Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292 (2014).
- Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
- . TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018)
- . NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018)
- Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
- Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells – current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
- Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
- Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
- Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498 (2016).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).
