Aislamiento, secuenciación y análisis de microRNA extracelular de las células madre mesenquimales humanas
Summary
Este protocolo muestra cómo purificar microRNAs extracelulares de medios de cultivo celular para la construcción de biblioteca de RNA pequeño y secuencia de la generación siguiente. Varios puestos de control de calidad se describen para permitir a los lectores a entender qué esperar cuando trabajan con baja entradas muestras como exRNAs.
Abstract
Extracelulares y circulación RNAs (exRNA) son producidos por muchos tipos de células del cuerpo y existen en numerosos fluidos corporales como saliva, plasma, suero, leche y orina. Un subconjunto de estos RNAs son los reguladores postranscripcional, microRNAs (miRNAs). Para delinear los miRNAs producido por tipos celulares específicos, sistemas de cultivo in vitro se pueden utilizar para cosechar y perfil exRNAs deriva de un subconjunto de las células. Los factores secretados de las células madre mesenquimales están implicados en el alivio de numerosas enfermedades y se utiliza como sistema de modelo in vitro. Este documento describe el proceso de recogida, purificación de ARN pequeño y generación de biblioteca a secuencia extracelular miRNAs. ExRNAs de medios de cultivo difieren de ARN celular por ser muestras entradas baja de RNA, que exige procedimientos optimizados. Este protocolo proporciona a una guía completa secuencia de pequeños exRNA de medios de cultivo, mostrando los puntos de control de control de calidad en cada paso durante la secuencia y la purificación de exRNA.
Introduction
Extracelular y circulación RNAs (exRNAs) están presentes en varios fluidos corporales y son resistentes a RNasas1,2. Su alta abundancia, estabilidad y facilidad de accesibilidad son atractivos para la evaluación clínica como marcadores diagnósticos y pronósticos3. El modo de transporte para exRNAs incluyen vesículas extracelulares (EVs), asociación con lipoproteínas (como lipoproteína de alta densidad; HDL) y los complejos de ribonucleoproteína (como con complejos Argonaute2)4.
Un subconjunto de exRNAs son microRNAs (miRNAs), que son pequeños no-codificación RNAs de unos 22 nt que regulan la expresión del gen postranscripcional. Ex-miRNAs se han implicado en la comunicación célula-célula y regulación de la homeostasis de la célula5. Por ejemplo, HDL ofrece ex-miR-223 a las células endoteliales para reprimir la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) y de la inflamación6. Curiosamente, miR-223 se ve transportado por vesículas extracelulares de los leucocitos a las células cancerosas de pulmón, programación para tomar a un fenotipo más invasiva de7. Así, el transcriptoma de ex-miRNAs de diversos fluidos corporales y el medio de cultivo celular mejorará grandemente nuestra comprensión de la ex-miRNA señalización.
ARN pequeño de secuencia (seq pequeñas de RNA) es una poderosa herramienta que puede utilizarse para comprender la transcriptómica de RNAs pequeño. No pueden comparar diferentes muestras entre RNAs conocidos diferencialmente expresados sólo novela small RNAs también pueden ser detectados y caracterizados. En consecuencia, es también un método robusto para identificar diferencialmente expresado miRNAs bajo diferentes condiciones. Sin embargo, uno de los obstáculos de pequeño RNA seq es la dificultad en la generación de pequeñas bibliotecas de seq de RNA de bajo exRNA entrada fluidos como líquido cefalorraquídeo, saliva, orina, leche, suero y medios de cultivo. El protocolo de TruSeq pequeños ARN biblioteca Prep de Illumina requiere aproximadamente 1 μg de ARN total de alta calidad y el protocolo de NEBNext ARN pequeño biblioteca Prep Set de New England Biolabs requiere 100 ng-1 μg de RNA8,9. A menudo, ARN total de las muestras están por debajo de límite de detección por espectrofotometría UV-vis convencional.
Ex-miRNAs derivados líquidos corporales son potencialmente buenos marcadores pronósticos y diagnósticos. Sin embargo, con el fin de estudiar los efectos funcionales o para determinar el origen de ex-miRNAs específicos, sistemas de cultivo de células se utilizan en su lugar. Las células madre mesenquimales (MSCs) han sido estudiadas extensivamente porque sus EVs se han implicado en el alivio de muchas enfermedades incluyendo el infarto del miocardio, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad injerto contra huésped10. Aquí, demostramos la purificación de ex-miRNAs de MSCs de médula ósea (BMSCs) y los pasos específicos que se utilizan para optimizar la construcción de biblioteca de pequeños RNA, secuenciación y análisis de datos (figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos un protocolo para la siguiente secuencia de generación de exRNAs que permite el análisis de expresión diferencial de las muestras de entrada baja. Adhesión a un protocolo específico para el aislamiento de EV y exRNA es importante porque incluso pequeñas alteraciones (es decir, el paso de ultracentrifugación o un cambio en el tipo de rotor) pueden influir en el transcriptoma y miRNA niveles13,14. Así, independientemente de cómo la exRNA…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Sr. Claus Bus y Sra. Rita Rosendahl en iNANO su asistencia técnica. Agradecimiento especial a Dr. Daniel Otzen para permitir el uso frecuente de su ultracentrífuga. Este estudio fue apoyado por el fondo de innovación de Dinamarca (proyecto MUSTER).
Materials
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol – used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
Referências
- Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).
- Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184 (2013).
- Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs – an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
- Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
- Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
- Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292 (2014).
- Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
- . TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018)
- . NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018)
- Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
- Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells – current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
- Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
- Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
- Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498 (2016).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).
