Isoleren, Sequencing en analyseren van extracellulaire MicroRNAs van menselijke mesenchymale stamcellen
Summary
Dit protocol laat zien hoe om te zuiveren van extracellulaire microRNAs van cel voedingsbodems voor kleine RNA bibliotheek constructie en de volgende generatie sequencing. Verschillende kwaliteitscontrole controlepunten worden beschreven om lezers te begrijpen wat u kunt verwachten wanneer u werkt met lage input monsters als exRNAs.
Abstract
Extracellulaire en circulerende RNAs (exRNA) worden geproduceerd door vele celtypes van het lichaam en in talrijke lichaamsvloeistoffen zoals speeksel, plasma, serum, melk en urine bestaan. Een subset van deze RNAs zijn de posttranscriptional regelgevende instanties – microRNAs (miRNAs). Om de miRNAs geproduceerd door specifieke celtypes af te bakenen, in vitro cultuur systemen kunnen worden gebruikt om te oogsten en profiel exRNAs afgeleid van een subset van de cellen. De secreted factoren van mesenchymale stamcellen zijn betrokken bij het verlichten van talrijke ziekten en wordt gebruikt als het modelsysteem van in-vitro hier. Deze paper beschrijft het proces van collectie, zuivering van kleine RNA en bibliotheek generatie reeks extracellulaire miRNAs. ExRNAs van voedingsbodems verschillen van cellulaire RNA door lage input monsters van RNA, waarin wordt gepleit voor geoptimaliseerde procedures. Dit protocol biedt een uitvoerige gids voor kleine exRNA sequencing van voedingsbodems, met kwaliteitscontrole controlepunten bij elke stap tijdens de zuivering van de exRNA en de sequencing.
Introduction
Extracellulaire en circuleren RNAs (exRNAs) zijn aanwezig in de verschillende lichaamsvloeistoffen en resistent zijn naar RNases1,2. Hun hoge overvloed, de stabiliteit en het gemak van toegankelijkheid zijn aantrekkelijk voor klinische beoordeling als diagnostische en prognostische markeringen3. De wijze van vervoer voor exRNAs omvatten extracellulaire blaasjes (EVs), vereniging met lipoproteïnen (zoals high-density lipoprotein; HDL) en ribonucleoprotein complexen (zoals met Argonaute2 complexen)4.
Een subset van exRNAs zijn microRNAs (miRNAs), die kleine niet-coderende RNAs van ongeveer 22 nt die regelen posttranscriptional genexpressie. Ex-miRNAs zijn betrokken bij de cel-cel communicatie en regulering van de cel homeostase5. Bijvoorbeeld, HDL ex-miR-223 levert aan endotheliale cellen te onderdrukken intercellulaire adhesie molecuul 1 (ICAM-1) en ontsteking6. MiR-223 is interessant, ook tijdens het vervoer door extracellulaire blaasjes uit leukocyten aan Long kankercellen, programmering te nemen op een meer invasieve fenotype7gezien. Transcriptome van ex-miRNAs van de verschillende lichaamsvloeistoffen en cel kweekmedium zal dus aanzienlijk verbeteren ons begrip van ex-miRNA signalering.
Kleine RNA sequencing (kleine RNA seq) is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om te begrijpen de transcriptomics van kleine RNAs. Niet alleen kunnen verschillende steekproeven onder differentially uitgedrukte bekende RNAs worden vergeleken, maar nieuwe kleine RNAs kunnen ook worden gedetecteerd en gekenmerkt. Het is bijgevolg ook een robuuste methode te identificeren differentially uitgedrukte miRNAs onder verschillende omstandigheden. Echter, een van de horden voor kleine RNA seq is de moeilijkheid bij het genereren van kleine RNA seq bibliotheken van lage exRNA input vloeistoffen zoals cerebrospinaal vocht, speeksel, urine, melk, serum en kweekmedia. Het TruSeq kleine RNA bibliotheek Prep-protocol van Illumina vereist ongeveer 1 microgram van totaal RNA van hoge kwaliteit en het instellen van NEBNext kleine RNA bibliotheek Prep protocol van New England Biolabs vereist 100 ng-1 µg van RNA8,9. Vaak, totaal RNA van deze monsters zijn onder de detectiegrens voor conventionele UV-vis spectrofotometers.
Ex-miRNAs afgeleid van lichaamssappen zijn potentieel goede prognostische en diagnostische markers. Echter, om de functionele gevolgen te bestuderen of om te bepalen van de oorsprong van bepaalde ex-miRNAs, cel cultuur systemen worden vaak gebruikt in plaats daarvan. Mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn uitvoerig bestudeerd omdat hun EVs zijn betrokken bij het verlichten van vele ziekten met inbegrip van myocardinfarct, ziekte van Alzheimer en graft versus host ziekte10. Hier tonen we de zuivering van ex-miRNAs van beenmerg-afgeleide MSCs (BMSCs) en de specifieke stappen gebruikt om kleine RNA bibliotheek constructie, sequencing en data-analyse (Figuur 1) te optimaliseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een protocol voor de volgende generatie sequentiebepaling van exRNAs waarmee differentiële expressie analyses van lage input monsters. Vasthouden aan een specifiek protocol voor EV en exRNA isolatie is belangrijk omdat zelfs kleine veranderingen (dat wil zeggen, de ultracentrifugatie stap of een verandering in de rotor type) invloed op transcriptome uitoefenen kunnen en miRNA niveaus13,14. Dus, ongeacht hoe de exRNA geïsoleerd is, is het bel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zijn dankbaar aan Mr. Claus Bus en mevrouw Rita Rosendahl op iNANO voor hun technische bijstand. Speciale dank aan Dr. Daniel Otzen voor het toestaan van het frequente gebruik van zijn ultracentrifuge. Deze studie werd gesteund door het innovatiefonds Denemarken (MUSTER-project).
Materials
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol – used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
Referências
- Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).
- Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184 (2013).
- Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs – an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
- Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
- Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
- Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292 (2014).
- Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
- . TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018)
- . NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018)
- Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
- Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells – current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
- Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
- Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
- Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498 (2016).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).
