Isolieren, Sequenzierung und Analyse von extrazellulären MicroRNAs aus humanen mesenchymalen Stammzellen
Summary
Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie extrazelluläre MicroRNAs von Zellkulturmedien für kleine RNA Bibliotheksbau und Sequenzierung der nächsten Generation zu reinigen. Verschiedenen Qualitätskontrolle Checkpoints werden beschrieben, Leser zu verstehen, was beim Arbeiten mit niedrigen Eingabesamples wie ExRNAs zu erwarten.
Abstract
Extrazelluläre und zirkulierenden RNAs (ExRNA) werden von vielen Zelltypen des Körpers produziert und gibt es in zahlreichen Körperflüssigkeiten wie Speichel, Urin, Milch, Plasma und Serum. Eine Teilmenge von diesen RNAs sind die posttranskritionelle Regler – Micro-RNAs (MiRNAs). Um die MiRNAs, die von bestimmten Zelltypen produziert abzugrenzen, in-vitro-Kultur-Systeme können verwendet werden, um zu ernten und Profil ExRNAs aus einer Teilmenge von Zellen. Die sezernierten Faktoren von mesenchymalen Stammzellen sind involviert in zahlreichen Krankheiten zu lindern und dient als die in-vitro-Modell-System hier. Dieser Artikel beschreibt den Prozess der Sammlung, Reinigung von kleinen RNA und Bibliothek-Generation, die Sequenz extrazelluläre MiRNAs. ExRNAs von Nährmedien unterscheiden sich von zellulären RNA durch die niedrigen RNA Eingabesamples, dem optimierten Verfahren gefordert. Dieses Protokoll bietet eine umfassende Anleitung zum kleinen ExRNA Sequenzierung von Nährmedien, zeigt Qualitätskontrolle Prüfpunkte bei jedem Schritt während ExRNA Reinigung und Sequenzierung.
Introduction
Extrazelluläre und zirkulierenden RNAs (ExRNAs) sind in verschiedenen Körperflüssigkeiten vorhanden und sind resistent gegen RNases1,2. Ihre hohe Fülle, Stabilität und einfache Zugänglichkeit sind attraktiv für klinische Bewertung als diagnostische und prognostische Marker3. Das Transportmittel für ExRNAs umfassen extrazelluläre Vesikel (EVs), Verband mit Lipoproteine (z. B. High-density-Lipoprotein; HDL) und Ribonucleoprotein komplexe (z. B. mit Argonaute2-komplexe)4.
Eine Teilmenge der ExRNAs sind Micro-RNAs (MiRNAs), die kleine nicht-kodierende RNAs von etwa 22 nt, die posttranskritionelle Genexpression regulieren. Ex-MiRNAs haben in Zell-Zell-Kommunikation und Regelung der Zelle Homöostase5verwickelt. Zum Beispiel liefert HDL Ex-MiR-223 an Endothelzellen interzelluläre Adhäsionsmolekül 1 (ICAM-1) zu unterdrücken und Entzündungen6. Interessanterweise wird MiR-223 auch transportiert durch extrazelluläre Vesikel von Leukozyten an Lungenkrebszellen, programmieren sie sich auf eine weitere invasive Phänotyp7gesehen. So wird das Transkriptom des Ex-MiRNAs aus verschiedenen Körperflüssigkeiten und Zellkulturmedium stark unser Verständnis von Ex-MiRNA-Signalisierung verbessern.
Kleine RNA Sequenzierung (kleine RNA Seq) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, zu verstehen, das Transkriptom des kleinen RNAs. Nicht nur verschiedene Proben unter differentiell exprimierten bekannten RNAs verglichen werden können, sondern neuartige kleinen RNAs auch erkannt und gekennzeichnet werden können. Infolgedessen ist es auch eine robuste Methode, differentiell exprimierten MiRNAs unter verschiedenen Bedingungen zu identifizieren. Eine der Hürden von kleinen RNA Seq ist jedoch die Schwierigkeiten bei der Erzeugung von kleinen RNA-Seq-Bibliotheken aus niedrigen ExRNA Eingabe Flüssigkeiten wie Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, Speichel, Urin, Milch, Serum und Nährmedien. Das TruSeq kleine RNA-Bibliothek-Prep-Protokoll von Illumina erfordert ca. 1 µg hochwertige Gesamt-RNS und das NEBNext kleine RNA Bibliothek Prep Set Protokoll von New England Biolabs 100 ng-1 µg RNA8,9. Oft sind total RNA aus diesen Proben unter Nachweisgrenze für konventionelle UV-Vis Spektralphotometer.
Ex-MiRNAs abgeleitet von Körperflüssigkeiten sind potenziell gute prognostische und diagnostische Marker. Jedoch sind um die funktionellen Auswirkungen zu studieren oder zur Bestimmung des Ursprungs von bestimmten Ex-MiRNAs Zellkultursysteme oft stattdessen verwendet. Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) haben ausgiebig untersucht, weil ihre EVs bei der Linderung vieler Krankheiten wie Herzinfarkt, Alzheimer-Krankheit und Graft-Versus-Host-Krankheit10verwickelt waren. Hier zeigen wir die Reinigung des Ex-MiRNAs aus dem Knochenmark stammenden MSCs (BMSCs) und die entsprechenden Schritte zur Optimierung der kleinen RNA Bibliotheksbau, Sequenzierung und Analyse der Daten (Abbildung 1) verwendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Sequenzierung der nächsten Generation von ExRNAs, die differentielle Expressionsanalysen aus niedrigen Eingabesamples ermöglicht. Die Einhaltung eines bestimmten Protokolls für EV und ExRNA Isolation ist wichtig, weil auch kleine Änderungen (z.B. der Ultrazentrifugation Schritt oder eine Änderung im Rotor Typ) auf das Transkriptom Einfluss können und MiRNA13,14 Ebenen. Also, unabhängig davon, wie die ExRNA isolie…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar, Herr Claus Bus und Frau Rita Rosendahl bei iNANO für ihre technische Unterstützung. Besonderen Dank an Dr. Daniel Otzen dafür, dass unsere häufigen Gebrauch von seinem Ultrazentrifugen. Diese Studie wurde unterstützt durch den Innovationsfonds Dänemark (MUSTER-Projekt).
Materials
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol – used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
Referências
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