Isolare, sequenziamento e analisi dei microRNA extracellulari dalle cellule staminali mesenchimali umane
Summary
Questo protocollo viene illustrato come purificare i microRNA extracellulari da terreni di coltura cellulare per piccoli RNA libreria costruzione e sequenziamento di nuova generazione. Vari punti di controllo di controllo di qualità sono descritti per permettere ai lettori di capire cosa aspettarsi quando si lavora con campioni di ingresso bassi come exRNAs.
Abstract
Extracellulare e circolanti RNAs (exRNA) sono prodotti da molti tipi di cellule del corpo ed esiste in numerosi liquidi corporei come saliva, plasma, siero, latte e urine. Un sottoinsieme di questi RNA sono i regolatori di posttranscriptional – i microRNA (Mirna). Per delineare i miRNA provocati da tipi cellulari specifici, sistemi di coltura in vitro possono essere utilizzati per la raccolta e il profilo exRNAs derivato da un sottoinsieme delle cellule. I fattori secreti di cellule staminali mesenchimali sono implicati nell’alleviazione numerose malattie e viene utilizzato come sistema modello in vitro qui. Questo articolo descrive il processo di raccolta, purificazione di piccolo RNA e generazione della libreria di sequenza extracellulare Mirna. ExRNAs da cultura media differiscono da RNA cellulare essendo Bassi campioni di RNA inpui, che chiama per procedure ottimizzate. Questo protocollo fornisce una guida completa al sequenziamento di piccolo exRNA da terreni di coltura, mostrando i punti di controllo di controllo di qualità ad ogni passo durante il sequenziamento e la purificazione di exRNA.
Introduction
Extracellulari e circolanti RNAs (exRNAs) sono presenti in vari liquidi corporei e sono resistenti verso RNasi1,2. Loro elevata abbondanza, la stabilità e la facilità di accessibilità sono attraenti per la valutazione clinica come marcatori diagnostici e prognostici3. La modalità di trasporto per exRNAs includere vescicole extracellulari (EVs), associazione con le lipoproteine (ad esempio di lipoproteina ad alta densità; HDL) e della ribonucleoproteina complessi (come con i complessi Argonaute2)4.
Un sottoinsieme di exRNAs sono i microRNA (Mirna), che sono piccoli RNA non codificanti di circa 22 nt che regolano l’espressione genica post-trascrizionale. Ex-miRNA sono stati implicati nella comunicazione cellula-cellula e regolazione di cella omeostasi5. Per esempio, HDL spedisce ex-miR-223 alle cellule endoteliali per reprimere la molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1) e infiammazione6. È interessante notare che, miR-223 è visto anche trasportati dalle vescicole extracellulari dai leucociti alle cellule tumorali del polmone, programmazione ad assumere un fenotipo più invasiva7. Così, il trascrittoma di ex-Mirna da vari fluidi corporei e terreno di coltura cellulare migliorerà notevolmente la nostra comprensione della segnalazione ex-miRNA.
Piccolo RNA (piccolo RNA seq) di sequenziamento è un potente strumento che può essere utilizzato per comprendere la trascrittomica di piccoli RNA. Non solo diversi campioni possono essere confrontati tra RNAs conosciuto differenzialmente espressi, ma romanzo piccoli RNA possa anche essere rilevati e caratterizzato. Di conseguenza, è anche un metodo affidabile per identificare Mirna differenzialmente espressi in condizioni diverse. Tuttavia, uno degli ostacoli di piccoli RNA seq è la difficoltà nel generare piccole biblioteche di seq RNA da exRNA basso input fluidi come liquidi cerebrospinali, saliva, urina, latte, siero e terreni di coltura. Il protocollo di TruSeq piccolo RNA biblioteca Prep da Illumina richiede circa 1 µ g di RNA totale di alta qualità e il protocollo di NEBNext piccolo RNA biblioteca Prep Set da New England Biolabs richiede 100 ng-1 µ g di RNA8,9. Spesso, RNA totale da questi campioni sono sotto il limite di rilevamento per spettrofotometri UV-vis convenzionali.
Ex-miRNAs derivati da fluidi corporei sono potenzialmente buoni marcatori diagnostici e prognostici. Tuttavia, al fine di studiare gli effetti funzionali o per determinare l’origine del ex-miRNA specifici, sistemi di coltura cellulare, vengono spesso utilizzati. Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono state studiate estesamente perché loro EVs sono stati implicati nell’alleviare molte malattie tra cui l’infarto miocardico, malattia di Alzheimer e dell’innesto contro la malattia ospite10. Qui, dimostriamo la purificazione di ex-Mirna da MSCs derivate da midollo osseo (BMSC) e i passaggi specifici utilizzati per ottimizzare la costruzione della libreria piccola RNA, sequenziamento e analisi dei dati (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo un protocollo per il sequenziamento di nuova generazione di exRNAs che consente l’analisi di espressione differenziale da campioni di ingresso Bassi. Aderendo a un protocollo specifico per l’isolamento di EV ed exRNA è importante perché anche piccole alterazioni (cioè, il passo di ultracentrifugazione o un cambiamento nel tipo di rotore) possono influenzare il trascrittoma e miRNA livelli13,14. Così, indipendentemente da come il exRNA è isol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati al signor Claus Bus e Sig. ra Rita Rosendahl a iNANO per loro assistenza tecnica. Si ringrazia Dr. Daniel Otzen per permettere che il nostro uso frequente della sua ultracentrifuga. Questo studio è stato sostenuto dal fondo per l’innovazione Danimarca (progetto MUSTER).
Materials
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol – used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
Referências
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