Isolando, sequenciamento e análise MicroRNAs extracelular das células-tronco mesenquimais humanas
Summary
Este protocolo demonstra como purificar microRNAs extracelular de meios de cultura celular para construção de biblioteca pequena do RNA e a próxima geração de sequenciamento. Vários pontos de verificação de controle de qualidade são descritos para permitir que os leitores a entender o que esperar quando se trabalha com amostras de entrada baixas como exRNAs.
Abstract
RNAs extracelulares e circulantes (exRNA) são produzidas por muitos tipos de células do corpo e existem em vários fluidos corporais como saliva, plasma, soro, leite e urina. Um subconjunto destes RNAs são os reguladores posttranscriptional – microRNAs (miRNAs). Para delinear os miRNAs produzidos por tipos de células específicas, sistemas de cultura in vitro podem ser usados para colher e perfil exRNAs derivado de um subconjunto de células. Os fatores secretados de células-tronco mesenquimais estão implicados em aliviar a inúmeras doenças e é usado como o sistema de modelo in vitro. Este artigo descreve o processo de coleta, purificação do RNA pequeno e geração de biblioteca para sequência de miRNAs extracelular. ExRNAs de meios de cultura diferem de RNA celular por serem amostras de entrada baixas de RNA, que exige procedimentos otimizados. Este protocolo fornece um guia completo para sequenciamento de pequenas exRNA de meios de cultura, mostrando pontos de verificação de controle de qualidade em cada etapa durante o sequenciamento e purificação de exRNA.
Introduction
Extracelular e circulando RNAs (exRNAs) estão presentes em vários fluidos corporais e são resistentes no sentido de RNases1,2. Sua abundância elevada, a estabilidade e a facilidade de acessibilidade são atraentes para avaliação clínica como marcadores de diagnóstico e prognóstico3. O modo de transporte para exRNAs incluir vesículas extracelulares (EVs), associação com lipoproteínas (tais como lipoproteína de alta densidade; HDL) e complexos ribonucleoprotein (tais como com complexos Argonaute2)4.
Um subconjunto de exRNAs são microRNAs (miRNAs), que são pequenos não-codificantes RNAs de cerca de 22 nt que regulam a expressão do gene posttranscriptional. Ex-miRNAs têm sido implicados na comunicação célula-célula e regulação da homeostase de células5. Por exemplo, o HDL entrega ex-miR-223 para células endoteliais para reprimir a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) e inflamação6. Curiosamente, miR-223 é também visto transportadas por vesículas extracelulares de leucócitos de células de câncer de pulmão, a fazer uma mais invasivo de fenótipo7programação. Assim, a transcriptoma do ex-miRNAs de vários fluidos corporais e meio de cultura celular grandemente irá melhorar a nossa compreensão de ex-miRNA sinalização.
Pequeno RNA sequenciamento (pequeno RNA seq) é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para entender a transcriptomics de RNAs pequeno. Não só podem diferentes amostras ser comparadas entre RNAs conhecidos diferencialmente expressos, mas RNAs pequeno romance também pode ser detectado e caracterizado. Consequentemente, é também um método robusto para identificar os miRNAs diferencialmente expressos em condições diferentes. No entanto, um dos obstáculos do pequeno RNA seq é a dificuldade em gerar pequenas bibliotecas seq de RNA a partir de exRNA baixa entrada fluidos como fluidos cérebro-espinhal, saliva, urina, leite, soro e meios de cultura. O protocolo de TruSeq pequeno RNA biblioteca Prep de Illumina requer aproximadamente 1 µ g de RNA total de alta qualidade e o protocolo de NEBNext pequeno RNA biblioteca Prep conjunto de New England Biolabs requer 100 µ g de ng-1 de RNA8,9. Muitas vezes, o RNA total destas amostras estão abaixo do limite de deteção para convencionais espectrofotômetros UV-vis.
Ex-miRNAs derivados de fluidos corporais são potencialmente bons marcadores de diagnósticos e prognósticos. No entanto, a fim de estudar os efeitos funcionais ou para determinar a origem do ex-miRNAs específicos, sistemas de cultura de células são usados frequentemente em vez disso. Células-tronco mesenquimais (MSCs) têm sido estudadas extensivamente porque seus EVs têm sido implicados em aliviar muitas doenças, incluindo infarto do miocárdio, a doença de Alzheimer e doença do enxerto contra hospedeiro10. Aqui, demonstramos a purificação do ex-miRNAs de medula óssea-derivado MSCs (BMSCs) e as etapas específicas usadas para otimizar a construção de biblioteca pequena do RNA, sequenciamento e análise de dados (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos um protocolo para o sequenciamento de geração próxima de exRNAs que permite análises de expressão diferencial de amostras de entrada baixas. Aderindo a um protocolo específico para isolamento EV e exRNA é importante porque mesmo pequenas alterações (ou seja, a etapa de ultracentrifugação ou uma mudança no tipo de rotor) podem influenciar a transcriptoma e miRNA níveis13,14. Assim, independentemente de como o exRNA é isolado, é imp…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nós estamos gratos ao Sr. Claus Bus e Sra. Rita Rosendahl em iNANO para sua assistência técnica. Agradecimentos especiais a Dr. Daniel Otzen para permitir que nosso uso frequente dele se. Este estudo foi suportado pelo fundo de inovação Dinamarca (revista projeto).
Materials
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol – used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
Referências
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