Isolera, sekvensering och analysera extracellulära mikroRNA från humana mesenkymala stamceller
Summary
Detta protokoll visar hur att rena extracellulära mikroRNA från cell Odlingsmedier för små RNA bibliotek konstruktion och nästa generations sekvensering. Olika kvalitetskontroll kontrollpunkter beskrivs att låta läsarna att förstå vad som väntar när du arbetar med låg input prover som exRNAs.
Abstract
Extracellulära och cirkulerande RNAs (exRNA) produceras av många celltyper i kroppen och finns i ett flertal kroppsvätskor som saliv, urin, mjölk, plasma och serum. En delmängd av dessa RNAs är de från tillsynsmyndigheterna – mikroRNA (Mirna). För att avgränsa den microRNA produceras av specifika celltyper, in vitro-kultur system kan användas för att skörda och profil exRNAs härrör från en delmängd av celler. De utsöndrade faktorerna av mesenkymala stamceller är inblandade i att lindra många sjukdomar och används som in vitro-modell systemet här. Detta dokument beskriver processen för insamling, rening av små RNA och bibliotek generation till sekvens extracellulära microRNA. ExRNAs från kultur media skiljer sig från cellulära RNA genom att vara låg RNA input prover, som uppmanar till optimerad förfaranden. Detta protokoll ger en omfattande guide till små exRNA sekvensering från kultur media, visar kvalitetskontroll kontrollpunkter vid varje steg under exRNA rening och sekvensering.
Introduction
Extracellulära och cirkulerande RNAs (exRNAs) är närvarande i olika kroppsvätskor och är resistenta mot Rnaser1,2. Deras höga överflöd, stabilitet och enkel tillgänglighet är attraktiva för kliniska bedömning som diagnostiska och prognostiska markörer3. Transportsätt för exRNAs inkluderar extracellulära blåsor (EVs), association med lipoproteiner (såsom high-density lipoprotein; HDL) och ribonukleoprotein komplex (såsom med Argonaute2 komplex)4.
En delmängd av exRNAs är mikroRNA (Mirna), som är små icke-kodande RNAs av cirka 22 nt som reglerar postttransskriptionell genuttryck. Ex-microRNA har varit inblandade i cell-cell kommunikation och reglering av cell homeostas5. Till exempel HDL levererar ex-miR-223 till endotelceller att förtränga intercellulära vidhäftning molekylen 1 (ICAM-1) och inflammation6. Intressant, ses miR-223 också transporteras av extracellulära blåsor från leukocyter till lungcancerceller, programmering dem att ta på en mer invasiv fenotyp7. Således kommer att transkriptom av ex-microRNA från olika kroppsvätskor och cellodlingsmedium kraftigt förbättra vår förståelse av ex-miRNA signalering.
Små RNA sekvensering (små RNA seq) är ett kraftfullt verktyg som kan användas för att förstå transkriptomik av små RNAs. Inte bara kan jämföra olika prover bland Differentiellt uttryckta kända RNAs, men romanen små RNAs kan också upptäckas och karakteriseras. Det är följaktligen också en robust metod att identifiera Differentiellt uttryckta microRNA under olika förhållanden. En av hindren av små RNA seq är dock svårigheten att generera små RNA seq bibliotek från låg exRNA ingående vätskor som cerebrospinala vätskor, saliv, urin, mjölk, serum och kultur media. TruSeq små RNA bibliotek Prep protokollet från Illumina kräver ungefär 1 µg av hög kvalitet total-RNA och NEBNext små RNA bibliotek Prep ange protokollet från New England Biolabs kräver 100 ng-1 µg RNA8,9. Ofta, total-RNA från dessa prover är nedanför detektionsgränsen för konventionella UV-vis spektrofotometrar.
Ex-microRNA härrör från kroppsvätskor är potentiellt bra Prognostiska och diagnostiska markörer. Men, för att studera de funktionella effekterna eller för att fastställa ursprunget på specifika ex-microRNA, cell kultur system används ofta istället. Mesenkymala stamceller (MSC) har studerats ingående eftersom deras EVs har varit inblandade i att lindra många sjukdomar inklusive hjärtinfarkt, Alzheimers sjukdom och graft versus host-sjukdom10. Här visar vi rening av ex-microRNA från benmärgen-derived MSCs (BMSCs) och de specifika steg som används för att optimera små RNA bibliotek konstruktion, sekvensering och dataanalys (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll för nästa generations sekvensering av exRNAs som möjliggör differentiell uttryck analyser från låg input prover. Det är viktigt att följa ett visst protokoll för EV och exRNA isolering eftersom även små förändringar (dvs steget ultracentrifugering eller en förändring i rotorn typ) kan påverka transkriptom och miRNA nivåer13,14. Således, oavsett hur exRNA är isolerade, är det viktigt att tillämpa samma experimen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma att Mr Claus buss och Ms. Rita Rosendahl på iNANO för deras tekniskt bistånd. Speciellt tack till Dr. Daniel Otzen för att låta våra frekventa användningen av hans ultracentrifugen. Denna studie stöddes av Danmarks Innovationsfonden (SAMLINGS-projektet).
Materials
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol – used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
Referências
- Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).
- Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184 (2013).
- Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs – an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
- Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
- Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
- Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292 (2014).
- Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
- . TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018)
- . NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018)
- Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
- Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells – current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
- Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
- Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
- Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498 (2016).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).
