Este protocolo demonstra como purificar microRNAs extracelular de meios de cultura celular para construção de biblioteca pequena do RNA e a próxima geração de sequenciamento. Vários pontos de verificação de controle de qualidade são descritos para permitir que os leitores a entender o que esperar quando se trabalha com amostras de entrada baixas como exRNAs.
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Artigo de método
Isolando, sequenciamento e análise MicroRNAs extracelular das células-tronco mesenquimais humanas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
RNAs extracelulares e circulantes (exRNA) são produzidas por muitos tipos de células do corpo e existem em vários fluidos corporais como saliva, plasma, soro, leite e urina. Um subconjunto destes RNAs são os reguladores posttranscriptional – microRNAs (miRNAs). Para delinear os miRNAs produzidos por tipos de células específicas, sistemas de cultura in vitro podem ser usados para colher e perfil exRNAs derivado de um subconjunto de células. Os fatores secretados de células-tronco mesenquimais estão implicados em aliviar a inúmeras doenças e é usado como o sistema de modelo in vitro. Este artigo descreve o processo de coleta, purificação do RNA pequeno e geração de biblioteca para sequência de miRNAs extracelular. ExRNAs de meios de cultura diferem de RNA celular por serem amostras de entrada baixas de RNA, que exige procedimentos otimizados. Este protocolo fornece um guia completo para sequenciamento de pequenas exRNA de meios de cultura, mostrando pontos de verificação de controle de qualidade em cada etapa durante o sequenciamento e purificação de exRNA.
Introdução
Extracelular e circulando RNAs (exRNAs) estão presentes em vários fluidos corporais e são resistentes no sentido de RNases1,2. Sua abundância elevada, a estabilidade e a facilidade de acessibilidade são atraentes para avaliação clínica como marcadores de diagnóstico e prognóstico3. O modo de transporte para exRNAs incluir vesículas extracelulares (EVs), associação com lipoproteínas (tais como lipoproteína de alta densidade; HDL) e complexos ribonucleoprotein (tais como com complexos Argonaute2)4.
Um subconjunto de exRNAs são microRNAs ....
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Protocolo
Nota: O meio de crescimento de células-tronco mesenquimais (mídia MSC) é preparado antecipadamente conforme indicado na Tabela de materiais.
1. cultura de pilha
Nota: Células-tronco mesenquimais humanas podem ser obtidas da medula óssea, tecido adiposo ou outras fontes de11. Alternativamente, hMSCs podem ser comprados através de um fornecedor. Os BMSCs usados no presente protocolo foram derivadas da medula óssea de pacientes e comprei de uma empresa.
- Descongele 1 x 106 BMSCs para um balão de T175 contendo 20 mL de mídia MSC. Incubar a 37 ° C com 5% CO<....
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Resultados
O método descrito neste protocolo é otimizado para coletar exRNA de cultura MSC para sequenciamento de próxima geração. O esquema geral de fluxo de trabalho está na Figura 1 , à esquerda e os pontos de verificação do respectivo controle de qualidade estão à direita.
A morfologia das células no dia da coleta para indiferenciado (Figura 3A) e diferenciados (
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Discussão
Aqui, descrevemos um protocolo para o sequenciamento de geração próxima de exRNAs que permite análises de expressão diferencial de amostras de entrada baixas. Aderindo a um protocolo específico para isolamento EV e exRNA é importante porque mesmo pequenas alterações (ou seja, a etapa de ultracentrifugação ou uma mudança no tipo de rotor) podem influenciar a transcriptoma e miRNA níveis13,14. Assim, independentemente de como o exRNA é isolado, é importante aplicar.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Nós estamos gratos ao Sr. Claus Bus e Sra. Rita Rosendahl em iNANO para sua assistência técnica. Agradecimentos especiais a Dr. Daniel Otzen para permitir que nosso uso frequente dele se. Este estudo foi suportado pelo fundo de inovação Dinamarca (revista projeto).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea | ATCC | PCS-500-012 | As células usadas neste protocolo foram compradas da ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | denominado meio de crescimento de células-tronco mesenquimais (mídia MSC) |
| Gibco | A2720801 | depleção de exossomos | |
| Gibco Mídia coletora: MSCGM, mas com o FBS substituído por FBS | |||
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Frasco | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Tamponado com Fosfato Salino | Sigma 806552 | ||
| Ultracentrífuga | Beckman Coulter | ||
| Frasco de Policarbonato com Conjunto de Tampa | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor usado aqui | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glicerophosphate | Calbiochem | 35675 | Componentes do meio de diferenciação osteogênica |
| Dexametasona | Sigma | D4902-25MG | Componentes do meio de diferenciação osteogênica |
| 2-Fosfo-L-ascórbico sal trissódico ácido | Sigma | 49752-10G | Componentes do meio de diferenciação osteogênica |
| 1&alfa;,25-Dihidroxivitamina D3 | Sigma | D1530-1MG | Componentes do meio de diferenciação osteogênica |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | kit de purificação de miRNA e RNA total para a etapa 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Máquina de eletroforese capilar baseada em chip e chips para análise de RNA e DNA |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Máquina de eletroforese capilar baseada em chip e chips para análise de RNA e DNA |
| Kit de DNA de Alta Sensibilidade Agilent | Technologies | 5067-4626 | Máquina de eletroforese capilar baseada em chip e chips para análise de RNA e DNA |
| Kits de quantificação da Biblioteca KAPA | de quantificação da biblioteca | Roche | KK4824 |
| Kit de preparação da biblioteca de RNA pequeno TruSeq - Conjunto A (24 rxns) (Conjunto A: índices 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Kit de preparação de biblioteca de RNA pequeno usado neste protocolo - usado na etapa 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Extrator automatizado de gel de DNA usado neste protocolo; a extração manual também pode ser feita | |
| purificação de PCR MinElute | Qiagen | 28004 | Purificação de PCR na etapa 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Corte de leituras de baixa qualidade na etapa 6 | |
| cutadapt | Remoção do adaptador na etapa 6 | ||
| Gravata | borboleta Mapeamento de leituras limpas na etapa 6 | ||
| Samtools | Para fazer o perfil de expressão na etapa 6 | ||
| Bedtools | Para fazer o perfil de expressão na etapa 6 |
Referências
- Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115(2013).
- Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circul....
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Reimpressões e permissões
