Fabrikasjon av Decellularized brusk-avledet Matrix stillaser
Summary
Decellularized brusk-avledet stillaser kan brukes som et stillas guide brusk reparasjon og som et middel til å regenerere osteochondral vev. Dette dokumentet beskriver decellularization i detalj og gir forslag til å bruke disse stillaser i vitro innstillinger.
Abstract
Osteochondral feil mangel iboende reparasjon kapasitet til å regenerere funksjonelt lyd bein og brusk vev. Til dette omfang, har brusk forskning fokusert på utvikling av regenererende stillaser. Denne artikkelen beskriver utviklingen av stillaser som helt stammer fra naturlige brusk ekstracellulær matrix, kommer fra en jevndøgn giver. Potensielle anvendelser av stillasene inkluderer produsere allografts brusk reparasjon, som et stillas for osteochondral vev engineering, og gir i vitro modeller for å studere vev formasjonen. Decellularizing vev, donor cellene er fjernet, men mange av de naturlige bioaktive signaler antas å bli beholdt. Den største fordelen med å bruke en naturlig stillaset i forhold til en syntetisk stillaset er at ingen ytterligere functionalization av polymerer er nødvendig for å kjøre osteochondral vev gjenfødelse. Brusk-avledet matrix stillasene kan brukes for bein og brusk vev gjenfødelse i både i vivo og in vitro innstillinger.
Introduction
Articular brusk feil i kneet forårsaket av traumatiske hendelser kan føre til ubehag og fremfor alt kan ha en stor innvirkning på livene til de unge og aktive1,2,3. Videre kan skader brusk i ung alder føre til en rask utbruddet av slitasjegikt senere i livet4. Foreløpig er bare berging behandling for generalisert slitasjegikt i kneet felles utskifting kirurgi. Brusk er en hypocellular, aneural og avascular vev, er regenererende kapasiteten sterkt begrenset. Derfor er regenerativ medisin tilnærminger ettertraktede å støtte og stimulere regenerativ kapasiteten av innfødte vev. For dette formålet, er stillasene utformet og brukes som enten en celle-operatør eller en induktiv materiale som oppfordrer differensiering og regenerering av vev av kroppens eget celler5.
Decellularized stillaser har vært mye studert i regenerativ medisin6. Det har hatt suksess, for eksempel i å hjelpe fornyelse av huden7, abdominal strukturer8og sener9. Fordelen med decellularized stillasene er deres naturlig opprinnelse og deres evne til å beholde bioaktive signaler som både tiltrekke og indusere celledifferensiering inn den riktige linjen kreves for vev reparasjon6,10. Videre siden ekstracellulær matrix (EFM) er en naturlig biomateriale, og decellularization forhindrer at en potensiell immunrespons ved å fjerne cellulære eller genetisk innhold, er spørsmål om biocompatibility og biologisk nedbrytbarhet overvunnet.
Brusk-avledet matrix (CDM) stillaser har vist store chondrogenic potensielle ved in vitro eksperimenter når seeded mesenchymal stromal celler11. Dessuten, har disse stillaser vist potensialet til skjemaet benvev gjennom endochondral forbening på ektopisk steder i vivo innstillinger12. Som CDM stillaser guide dannelsen av begge bein og brusk vev, disse stillaser kan holde potensielle osteochondral defekt reparasjon i tillegg brusk reparasjon.
Denne artikkelen beskriver en protokoll tilpasset fra Yang et al. (2010)13 for produksjon av decellularized CDM stillaser fra equine kvele brusk. Disse stillasene er rik i collagen type II og blottet for celler, og inneholder ikke noen glycosaminoglycans (GAGs) etter decellularization. Både i vitro og in vivo eksperimenter på (osteo) chondral defekt reparasjon kan utføres ved hjelp av disse stillaser.
Protocol
Representative Results
Discussion
ECM av articular brusk er svært tett og helt motstandsdyktige mot ulike enzymatisk behandlinger. Flere trinn decellularization protokollen beskrevet i denne artikkelen løser slik motstand og genererer vellykket decellularized matriser. For å oppnå dette, spenner prosessen over flere dager. Mange decellularization prosesser er foreslått for ulike typer vev18, og denne artikkelen beskriver en protokoll som er egnet for decellularization av brusk. I denne protokollen er det imidlertid nødvendig…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å erkjenne W. støvel for hjelp i produksjonen av stillasene. K.E.M. Benders støttes av Alexandre Suerman Stipendium fra University Medical Center. R. Levato og J. Malda støttes av nederlandske leddgikt Foundation (gi avtaler CO-14-1-001 og LLP-12, henholdsvis).
Materials
| Cadaveric joint | This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center. | ||
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290026 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fischer Scientific | 25200072 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| Triton X-100 (octoxynol-1) | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Alginate | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Formalin | |||
| CaCl2 | |||
| Ethanol | |||
| Xylene | |||
| Paraffin | |||
| Ethylene oxide sterilization | Synergy Health, Venlo, the Netherlands | ||
| Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors | MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center. | ||
| MEM alpha | Thermo Fischer Scientific | 22561 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| DMEM | Thermo Fischer Scientific | 41965 | |
| Heat inactivated bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 10735086001 | |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) | R & D Systems | 233-FB | |
| DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent) | Thermo Fischer Scientific | P7581 | |
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| Freeze-dryer | SALMENKIPP | ALPHA 1-2 LD plus | |
| Analytical mill | IKA | A 11 basic | |
| mortar/pestle | Haldenwanger 55/0A | ||
| Roller plate | CAT | RM5 | |
| Centrifuge (for 50 mL tubes) | Eppendorf | 5810R | |
| Capsule (cylindric mold) | TAAB | 8 mm flat | |
| Superlight S UV | Lumatec | 2001AV | |
| Incubator | |||
| Microtome | |||
| Sieve (mesh size 0.71 mm) | VWR | 34111229 | |
| Scalpel | |||
| Scalpel holder | |||
| Small laddle |
Referências
- Dunlop, D. D., et al. Risk factors for functional decline in older adults with arthritis. Arthritis and rheumatism. 52 (4), 1274-1282 (2005).
- Fitzpatrick, K., Tokish, J. M. A military perspective to articular cartilage defects. The journal of knee surgery. 24 (3), 159-166 (2011).
- Flanigan, D. C., Harris, J. D., Trinh, T. Q., Siston, R. A., Brophy, R. H. Prevalence of chondral defects in athletes’ knees: a systematic review. Medicine and science in sports and exercise. 42 (10), 1795-1801 (2010).
- Martel-Pelletier, J., Boileau, C., Pelletier, J. P., Roughley, P. J. Cartilage in normal and osteoarthritis conditions. Best practice & research. Clinical rheumatology. 22 (2), 351-384 (2008).
- Vinatier, C., et al. Cartilage tissue engineering: towards a biomaterial-assisted mesenchymal stem cell therapy. Current stem cell research & therapy. 4 (4), 318-329 (2009).
- Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
- Vashi, C. Clinical Outcomes for Breast Cancer Patients Undergoing Mastectomy and Reconstruction with Use of DermACELL, a Sterile, Room Temperature Acellular Dermal Matrix. Plastic Surgery International. 2014 (704323), 1-7 (2014).
- Satterwhite, T. S., et al. Abdominal wall reconstruction with dual layer cross-linked porcine dermal xenograft: the "Pork Sandwich" herniorraphy. Journal of plastic, reconstructive & aesthetic surgery : JPRAS. 65 (3), 333-341 (2012).
- Martinello, T., et al. Successful recellularization of human tendon scaffolds using adipose-derived mesenchymal stem cells and collagen gel. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 8 (8), 612-619 (2014).
- Benders, K. E., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
- Benders, K. E., et al. Multipotent Stromal Cells Outperform Chondrocytes on Cartilage-Derived Matrix Scaffolds. Cartilage. 5 (4), 221-230 (2014).
- Gawlitta, D., et al. Decellularized cartilage-derived matrix as substrate for endochondral bone regeneration. Tissue engineering. Part A. 21 (3-4), 694-703 (2015).
- Yang, Z., et al. Fabrication and repair of cartilage defects with a novel acellular cartilage matrix scaffold. Tissue engineering. Part C, Methods. 16 (5), 865-876 (2010).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Meyer, S. R., et al. Decellularization reduces the immune response to aortic valve allografts in the rat. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 130 (2), 469-476 (2005).
- Brown, B. N., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., McCabe, G. P., Badylak, S. F. Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component. Biomaterials. 30 (8), 1482-1491 (2009).
- Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Malda, J., et al. Of mice, men and elephants: the relation between articular cartilage thickness and body mass. PloS One. 8 (2), e57683 (2013).
- Malda, J., et al. Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Annals of biomedical engineering. 43 (3), 577-592 (2015).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. 113 (7), 2217-2222 (2012).
