Tillverkning av cell-lösa brosk-derived Matrix ställningar
Summary
Cell-lösa brosk-derived ställningar kan användas som en byggnadsställning till guide brosk reparation och som ett sätt för att regenerera osteokondrala vävnad. Detta dokument beskriver hur decellularization i detalj och ger förslag att använda dessa ställningar i in vitro-inställningar.
Abstract
Osteokondrala defekter saknar tillräcklig inneboende reparation kapacitet att regenerera funktionellt ljud ben och brosk vävnaden. I denna utsträckning, har brosk forskning fokuserat på utvecklingen av regenerativ ställningar. Denna artikel beskriver utvecklingen av ställningar som helt härrör från naturliga brosk extracellulärmatrix, kommer från ett equine givare. Potentiella tillämpningar av ställningar inkluderar producerar organtransplantationer för brosk reparation, som fungerar som en klätterställning för osteokondrala tissue engineering och ge in vitro-modeller för att studera vävnad bildas. Av decellularizing vävnad, donatorcellerna tas bort, men många av de naturliga bioaktiva cues tros finnas kvar. Den största fördelen med att använda en sådan naturlig byggnadsställning i jämförelse med en syntetiskt framställd byggnadsställning är att ingen ytterligare funktionalisering av polymerer är skyldig att driva osteokondrala vävnadsregeneration. De brosk-derived matrix ställningar kan användas för ben och brosk vävnadsregeneration i både in vivo och in vitro-inställningar.
Introduction
Ledbrosk defekter i knät orsakas av traumatiska händelser kan leda till obehag, och framför allt kan ha en stor inverkan på livet för de unga och aktiva befolkningen1,2,3. Broskskador i unga år kan dessutom leda till en snabbare insättande av artros senare i livet4. För närvarande är den enda bärgning behandlingen för generaliserad artros i knä Ledbyteskirurgi. Brosk är en hypocellular, aneural och avaskulär vävnad, är dess regenerativ kapacitet starkt begränsad. Regenerativ medicin metoder är därför eftertraktade stöd och stimulera regenerativ kapacitet av infödda vävnad. För detta ändamål ställningar utformas och används som antingen en cell-bärare eller som en induktiv material som uppviglar differentiering och förnyelse av vävnad av kroppens infödda celler5.
Cell-lösa ställningar har studerats allmänt inom regenerativ medicin6. Det har haft viss framgång, till exempel i medhjälp förnyelse av huden7, buken strukturer8och senor9. Fördelen med att använda cell-lösa ställningar är deras naturligt ursprung och deras kapacitet att behålla bioaktiva ledtrådar som både lockar och inducera celldifferentiering in lämpliga släktlinje krävs för vävnad reparera6,10. Dessutom eftersom extracellulär matrix (ECM) är en naturlig biomaterial, och decellularization förhindrar en potentiell immunsvaret genom att ta bort cellular eller genetiska innehåll, är frågor rörande biokompatibilitet och biologisk nedbrytbarhet övervinnas.
Brosk-derived matris (CDM) ställningar har visat stor chondrogenic potential i in vitro-experiment när seedade med mesenkymala stromaceller11. Dessutom, har dessa ställningar visat potential att bilda benvävnad genom endochondral benbildning på ektopisk platser i invivo inställningar12. Som CDM ställningar guide bildandet av både ben och brosk vävnaden, dessa ställningar kan hålla potentiella för osteokondrala defekt reparation utöver brosk reparation.
Den här artikeln beskrivs ett protokoll som anpassas från Yang et al. (2010)13 för produktion av cell-lösa CDM ställningar från hästdjur kväva brosk. Dessa ställningar är rika i kollagen typ II och saknar celler, och innehåller inte någon glykosaminoglykaner (GAG) efter decellularization. Både in vitro- och in vivo försök på (osteoartrit) chondral defekt reparation kan utföras med hjälp av dessa ställningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
ECM av ledbrosk är mycket tät och ganska motståndskraftig mot olika enzymatiska behandlingar. Flerstegs decellularization protokollet beskrivs i denna artikel behandlar sådana motstånd och genererar framgångsrikt cell-lösa matriser. För att uppnå detta, spänner processen över flera dagar. Många decellularization processer har föreslagits för olika typer av vävnader18, och den här artikeln beskrivs ett protokoll som är lämplig för decellularization av brosk. I detta protokoll är…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna W. Boot för stöd i produktionen av ställningar. K.E.M. Benders stöds av Alexandre Suerman Stipendium från University Medical Center. R. Levato och J. Malda stöds av holländska Arthritis Foundation (bidragsavtal CO-14-1-001 och LLP-12, respektive).
Materials
| Cadaveric joint | This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center. | ||
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290026 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fischer Scientific | 25200072 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| Triton X-100 (octoxynol-1) | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Alginate | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Formalin | |||
| CaCl2 | |||
| Ethanol | |||
| Xylene | |||
| Paraffin | |||
| Ethylene oxide sterilization | Synergy Health, Venlo, the Netherlands | ||
| Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors | MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center. | ||
| MEM alpha | Thermo Fischer Scientific | 22561 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| DMEM | Thermo Fischer Scientific | 41965 | |
| Heat inactivated bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 10735086001 | |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) | R & D Systems | 233-FB | |
| DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent) | Thermo Fischer Scientific | P7581 | |
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| Freeze-dryer | SALMENKIPP | ALPHA 1-2 LD plus | |
| Analytical mill | IKA | A 11 basic | |
| mortar/pestle | Haldenwanger 55/0A | ||
| Roller plate | CAT | RM5 | |
| Centrifuge (for 50 mL tubes) | Eppendorf | 5810R | |
| Capsule (cylindric mold) | TAAB | 8 mm flat | |
| Superlight S UV | Lumatec | 2001AV | |
| Incubator | |||
| Microtome | |||
| Sieve (mesh size 0.71 mm) | VWR | 34111229 | |
| Scalpel | |||
| Scalpel holder | |||
| Small laddle |
Referências
- Dunlop, D. D., et al. Risk factors for functional decline in older adults with arthritis. Arthritis and rheumatism. 52 (4), 1274-1282 (2005).
- Fitzpatrick, K., Tokish, J. M. A military perspective to articular cartilage defects. The journal of knee surgery. 24 (3), 159-166 (2011).
- Flanigan, D. C., Harris, J. D., Trinh, T. Q., Siston, R. A., Brophy, R. H. Prevalence of chondral defects in athletes’ knees: a systematic review. Medicine and science in sports and exercise. 42 (10), 1795-1801 (2010).
- Martel-Pelletier, J., Boileau, C., Pelletier, J. P., Roughley, P. J. Cartilage in normal and osteoarthritis conditions. Best practice & research. Clinical rheumatology. 22 (2), 351-384 (2008).
- Vinatier, C., et al. Cartilage tissue engineering: towards a biomaterial-assisted mesenchymal stem cell therapy. Current stem cell research & therapy. 4 (4), 318-329 (2009).
- Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
- Vashi, C. Clinical Outcomes for Breast Cancer Patients Undergoing Mastectomy and Reconstruction with Use of DermACELL, a Sterile, Room Temperature Acellular Dermal Matrix. Plastic Surgery International. 2014 (704323), 1-7 (2014).
- Satterwhite, T. S., et al. Abdominal wall reconstruction with dual layer cross-linked porcine dermal xenograft: the "Pork Sandwich" herniorraphy. Journal of plastic, reconstructive & aesthetic surgery : JPRAS. 65 (3), 333-341 (2012).
- Martinello, T., et al. Successful recellularization of human tendon scaffolds using adipose-derived mesenchymal stem cells and collagen gel. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 8 (8), 612-619 (2014).
- Benders, K. E., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
- Benders, K. E., et al. Multipotent Stromal Cells Outperform Chondrocytes on Cartilage-Derived Matrix Scaffolds. Cartilage. 5 (4), 221-230 (2014).
- Gawlitta, D., et al. Decellularized cartilage-derived matrix as substrate for endochondral bone regeneration. Tissue engineering. Part A. 21 (3-4), 694-703 (2015).
- Yang, Z., et al. Fabrication and repair of cartilage defects with a novel acellular cartilage matrix scaffold. Tissue engineering. Part C, Methods. 16 (5), 865-876 (2010).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Meyer, S. R., et al. Decellularization reduces the immune response to aortic valve allografts in the rat. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 130 (2), 469-476 (2005).
- Brown, B. N., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., McCabe, G. P., Badylak, S. F. Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component. Biomaterials. 30 (8), 1482-1491 (2009).
- Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Malda, J., et al. Of mice, men and elephants: the relation between articular cartilage thickness and body mass. PloS One. 8 (2), e57683 (2013).
- Malda, J., et al. Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Annals of biomedical engineering. 43 (3), 577-592 (2015).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. 113 (7), 2217-2222 (2012).
