Nanopartículas de óxido de ferro revestido de Polyethyleneimine como um veículo para a entrega de RNA de interferência pequeno para macrófagos In Vitro e In Vivo
Summary
Nós descrevemos um método de usar polyethyleneimine (PEI)-revestido de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético para macrófagos transfecting com siRNA. Essas nanopartículas podem eficientemente entregar siRNA expressão macrófagos gene-alvo em vitro e in vivo e silêncio.
Abstract
Devido ao seu papel crítico na regulação da resposta imune, os macrófagos continuamente tenham sido objecto de intensa investigação e representam um alvo terapêutico promissor em muitas doenças, como doenças auto-imunes, aterosclerose e câncer. Silenciamento de genes mediada por RNAi é uma valiosa abordagem de escolha para investigar e manipular a função de macrófagos; no entanto, o transfeccao de macrófagos com siRNA é considerado frequentemente para ser tecnicamente desafiador, e, neste momento, algumas metodologias dedicadas para a transferência de siRNA para macrófagos estão disponíveis. Aqui, apresentamos um protocolo do uso de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético polyethyleneimine-revestido (PEI-SPIONs) como um veículo para a entrega de alvo de siRNA para macrófagos. PEI-SPIONs são capazes de vinculação e completamente condensação siRNA quando a relação de peso de Fe: siRNA atinge 4 e acima. In vitro, essas nanopartículas podem eficientemente entregar siRNA em macrófagos primários, bem como para a linha de celular de macrófagos, como 264.7 crus, sem comprometer viabilidade celular na dose ideal para transfeccao, e, em última análise, eles induzem silenciamento de genes mediada por siRNA alvo. Além de ser usado para em vitro transfeccao siRNA, PEI-SPIONs são também uma ferramenta promissora para a entrega de siRNA para macrófagos na vivo. Tendo em conta as suas características combinadas de propriedade magnética e silenciamento capacidade, sistemicamente administrado PEI-SPION/siRNA partículas são esperadas não só para modular a função de macrófagos, mas também para ativar macrófagos para ser fotografado e rastreado. Em essência, PEI-SPIONs representam uma plataforma nonviral simples, segura e eficaz para a entrega de siRNA para macrófagos tanto in vitro e in vivo.
Introduction
Os macrófagos são um tipo de células do sistema imune inatos distribuídos em todos os tecidos do corpo, embora em quantidades diferentes. Produzindo uma variedade de citocinas e outros mediadores, eles desempenham papéis críticos na defesa do hospedeiro contra patógenos microbianos a invadir, na reparação de tecidos após lesão e na manutenção da homeostase de tecido1. Devido à sua importância, os macrófagos continuamente tenham sido objecto de intensa investigação. No entanto, apesar de sua prevalência em estudos de função e regulação gênica, silenciamento de genes mediada por siRNA é menos susceptível de ter êxito em macrófagos, porque estas células — particularmente, macrófagos primários — são frequentemente difíceis de transfect. Isto pode ser atribuído a um grau relativamente elevado de toxicidade associado com abordagens de transfeccao mais bem estabelecidas que a membrana celular é quimicamente (por exemplo, com polímeros e lipídios) ou fisicamente (por exemplo, por eletroporação e armas de gene) interrompeu deixar siRNA moléculas atravessam a membrana, reduzindo assim drasticamente viabilidade de2,3 dos macrófagos. Além disso, os macrófagos são os fagócitos dedicados ricos em enzimas degradativos. Estas enzimas podem danificar a integridade do siRNA, enfraquecendo sua eficiência silencioso mesmo se siRNA gene-específico foi entregue para a célula3,4. Portanto, precisa de um sistema de entrega de siRNA macrófago-alvo eficaz proteger a integridade e a estabilidade de siRNA durante entrega4.
É cada vez mais evidente que macrófagos disfuncionais estão implicados na iniciação e progressão de certas desordens clínicas comuns como doenças auto-imunes, aterosclerose e câncer. Por este motivo, modulando a função do macrófago com, por exemplo, siRNA, tem sido a emergir como uma metodologia atraente para o tratamento destes transtornos5,6,7. Embora muito progresso tem sido feito, um grande desafio da estratégia de tratamento baseado em siRNA é a especificidade da célula pobre de siRNA sistemicamente administrado e a absorção de siRNA insuficiente pelos macrófagos, que, consequentemente, levar a efeitos colaterais indesejados. Comparado com terapêutica de ácido nucleico livre que geralmente carecem de seletividade de célula ideal e muitas vezes levam a efeitos adversos, carregado de drogas nanopartículas (NPs), devido à sua propensão espontânea de ser capturado pelo sistema reticuloendotelial, fora do alvo pode ser projetada para o direcionamento passiva de macrófagos na vivo, permitindo a maior eficácia terapêutica com efeitos colaterais mínimos8. Atual NPs explorado para a entrega de moléculas do RNA incluem nanocarriers inorgânicos e lipossomas diversos polímeros9. Entre eles, o polyethyleneimine (PEI), um tipo de polímeros cationic capazes de vinculação e condensação de ácidos nucleicos em NPs estabilizado, mostra o RNA maior fornecimento de capacidade9,10. PEI protege os ácidos nucleicos de degradação enzimática e nonenzymatic, Medeia sua transferência através da membrana celular e promove sua liberação intracelular. Embora inicialmente introduzido como um reagente de entrega de DNA, PEI foi posteriormente demonstrado ser uma plataforma atrativa para na vivo entrega siRNA, localmente ou sistemicamente9,10.
Nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético (SPIONs) tem mostrado grande promessa na biomedicina, devido às suas propriedades magnéticas, biocompatibilidade, tamanho comparável aos objetos biologicamente importantes, alta proporção de superfície-área-volume e facilmente adaptável superfície para o bioagente anexo11. Por exemplo, por causa de sua utilidade potencial como um agente de contraste e rápida absorção por macrófagos, SPIONs surgiram como uma ferramenta clínica favorita para imagem de macrófagos de tecido12. Enquanto SPIONs também têm sido muito estudados como ácido nucleico entrega veículos11,13,14,15, nosso conhecimento, a literatura contém alguns relatos de SPIONs como um portador para entrega de siRNA macrófago-alvo. Para a entrega do gene por SPIONs, sua superfície geralmente é revestida com uma camada de polímeros cationic hidrofílicos na qual carregados negativamente ácidos nucleicos pode ser eletrostaticamente atraiu e amarrados. Aqui, apresentamos um método para a síntese de SPIONs cuja superfície é modificada com baixo peso molecular (10 kDa), ramificada PEI (PEI-SPIONs). Estes nanoplatforms magnéticos então são empregados para condensar siRNA, formando complexos de PEI-SPION/siRNA que permitem o transporte de siRNA para a célula. Nós razão aquela espontânea fagocitose de SPIONs pelas células do sistema reticuloendotelial16, juntamente com a forte capacidade de ligação e condensação de ácidos nucleicos por PEI, processa a PEI-SPIONs apropriado para o transporte eficiente de siRNA em macrófagos. Os dados apresentados aqui apoiar a viabilidade de silenciamento de genes PEI SPION/siRNA-mediada em macrófagos na cultura, bem como na vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os macrófagos são refratários a transfect por abordagens nonviral comumente usadas, como espécie de lipídios, lipossomas catiônicos e eletroporação. Aqui nós descrevemos um método confiável e eficiente para transfect macrófagos com siRNA. Utilizando o presente protocolo, mais 90% dos macrófagos, como 264.7 pilhas (Figura 2B) e de macrófagos peritoneais de ratos18 pode ser transfected com siRNA sem deterioração significativa da viabilidade celular. Esse…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo programa de desenvolvimento da China (n. º 2017YFA0205502) e nacional chave de pesquisa e a Fundação Nacional de ciências naturais da China (81772308).
Materials
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal bovine serum | Gibco | A31608-02 | |
| Penicillin/streptomycin (1.5 ml) | Gibco | 15140122 | |
| Tetrazolium-based MTS assay kit | Promega | G3582 | For cytotoxicity analysis |
| RAW 264.7 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China | TCM13 | |
| Tissue culture plates (6-well) | Corning | 3516 | |
| Tissue culture dishes (10 cm) | Corning | 430167 | |
| RNase-free tubes (1.5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430791 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| Wistar rats | Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences |
||
| Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder | National Institutes for Food and Drug Control, China |
for inducing adjuvant arthritis in rats | |
| siRNA | GenePharma (Shanghai, China) | ||
| Cy3-siRNA | RiboBio (Guangzhou, China) | ||
| Polyethyleneimine (10 kDa) | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | E107079 | |
| Ammonia water | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | A112077 | |
| Oleic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | O108484 | |
| Dimethylsulfoxide | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D103272 | |
| FeSO4•7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012118 | |
| FeCl3•6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | |
| Dimercaptosuccinic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D107254 | |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC910096 | |
| Tetramethylammonium hydroxide solution | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | T100882 | |
| Particle size and zeta potential analyzer | Malvern, England | Nano ZS90 |
Referências
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