Effekterna av smak signalering Protein Abolishment på Gut Inflammation i en musmodell för inflammatorisk tarmsjukdom sjukdom
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att undersöka effekten av upphävandet av gustation-relaterade gener på immunsvaret hos en dextran sulfat natrium (DSS)-inducerad musmodell för inflammatorisk tarmsjukdom sjukdom (IBD).
Abstract
Inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) är en av de immunrelaterade gastrointestinala störningar, inklusive ulcerös kolit och Crohns sjukdom, som påverkar livskvaliteten för miljontals människor världen över. IBD symtom är buksmärtor, diarré och rektal blödning, vilket kan resultera från interaktioner mellan tarmfloran, matdelar, tarmepitelceller och immunceller. Det är särskilt viktigt att bedöma hur varje nyckel gen uttryckt i tarmens epitelceller och immun cellerna påverkar inflammation i tjocktarmen. G-proteinkopplade smak receptorer, inklusive G protein subenhet α-gustducin och andra signalering proteiner, har hittats i tarmen. Här, vi använder α-gustducin som representant och beskriva en dextran sulfat natrium (DSS)-inducerad IBD-modell för att utvärdera effekten av luktintrycket genmutationer på gut slemhinnor immunitet och inflammation. Denna metod kombinerar genteknik knockout med kemiskt inducerad IBD-modellen och därmed kan användas för att bedöma resultatet av luktintrycket gen upphävda samt andra gener som kan andas eller dämpa immunsvaret DSS-inducerad i tjocktarmen. Muterade möss administreras med DSS för en viss period under vilken deras kroppsvikt, pall och rektal blödning övervakas och registreras. Vid olika tidpunkter under administration, vissa möss är euthanized, sedan de storlekar och vikter för sin mjälte och kolon mäts och gut vävnader samlas in och bearbetas för histologiska och gen uttryck analyser. Data visar att α-gustducin knockout resultaten i överdriven viktminskning, diarré, intestinal blödning, vävnadsskada och inflammation vs. vildtyps-möss. Eftersom svårighetsgraden av inducerad inflammation påverkas av mus stammar, boendemiljö och kost, är optimering av DSS koncentration och administration varaktighet i en pilot experiment särskilt viktigt. Genom att justera dessa faktorer, kan denna metod användas för att bedöma både anti – och pro-inflammatoriska effekter.
Introduction
De två stora formerna av inflammatorisk tarmsjukdom (IBD), Crohns sjukdom (CD) och ulcerös kolit (UC) kännetecknas av kronisk remitterande eller progressiv inflammatoriska tillstånd i tarmen med multifaktoriell etiologi1,2 . Utvecklingen av IBD beror på genetiska samt vissa miljöfaktorer som kost, användning av antibiotika, och ännu viktigare, patogena infektioner. De etiologi och reglerande molekylära mekanismer bakom IBD är dock fortfarande oklart. Talrika kemiskt inducerad IBD djurmodeller har därför konstruerats och tillämpas för att avgränsa den patogenes och reglerande mekanismer och utvärdera effektiviteten av mänskliga therapeutics3.
Smak receptorer är G-proteinkopplade receptorer (varandra) och klassificeras som två typer: typ I (T1Rs) och typ II (T2Rs) som upptäcker sweet, umami och bitter föreningar. Smak signalering cascades initieras av tastant binder till T1Rs eller T2Rs, aktivera heterotrimeric G proteiner bestående av α-gustducin och en Gβγ dimer och leder till frisättning av Gβγ subunitsna. Den Gβγ delen stimulerar i sin tur nedströms effektor enzymet fosfolipas C-β2 (PLC-β2). Aktiverade PLC-β2 sedan hydrolyserar fosfatidylinositol-4,5-bisphosphate i två intracellulära sekundära budbärare [inositol-1,4,5-trisphosphate (IP-3) och diglyceridolja] och IP-3 binder till och öppna dess kanal-receptor IP3 R3, släppa kalciumjoner från endoplasmatiska retiklet. Detta leder så småningom till öppnandet av transient receptor potential jonkanal Trpm5 och frisättning av signalsubstansen ATP på luktintrycket nerver4,5,6,7. Men är signalvägar som salt och syrlig smak olika och oberoende från sweet, umami och bittra smaker8. I tillägg finns de komponenter av smak varandra och nedströms proteiner i olika extra orala vävnader. Nyligen genomförda studier indikerade att α-gustducin, befinns huvudkomponenten i smak signalering, uttryckas i tarmslemhinnan. Ytterligare studier behövs för att förstå funktionerna i dessa smak signalering komponenter i extra orala vävnader9,10.
Den metod som beskrivs här används för att karakterisera funktioner av luktintrycket signalering proteinerna uttrycks i extra orala vävnader. Vi kombinerar en transgen mus linje utvecklats för avgränsar signalering cascades i smaklökar med kemiskt inducerad kolit modellen. Till stor del på grund av dess processuella enkelhet och patologiska likheter med människans ulcerös kolit, dextran sulfat natrium (DSS)-inducerad IBD modell har använts mest bland olika kemiskt inducerad kolit modeller11. I denna studie använde vi α-gustducin-brist möss som en representativ mus linje för att avslöja nya funktioner av α-gustducin i tarmen slemhinnor immunitet och inflammation genom att 1) analysera morfologiska förändringar i vävnaden och 2) testmetoder skillnader i uttrycket av cytokiner som relaterade till inflammation i tjocktarmen. Denna metod kan användas för att kvantitativt och kvalitativt bestämma luktintrycket signalering proteiner (och andra proteiner som uttrycks i tarmen) bidrag till vävnadsskador och tarminflammation, när genetiskt modifierade mus linjer för gener intresse finns. Fördelarna med denna metod möjliggör användare att få integrerade data som härrör från åtgärder i både kemiska DSS och brist av genen av intresse. Denna metod kan förbättras ytterligare för att öka dess känslighet och avslöjar subtila intestinal förändringar på cellulär och molekylär nivå.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna metod kan användas för att kvantitativt bestämma effekten av mutationer i specifika luktintrycket gener på inflammation i en musmodell för DSS-inducerad IBD. För att dra full nytta, är optimal induktion av IBD ett viktigt steg. Utvecklingen av kolit påverkas av flera faktorer, inklusive mus stam, boendemiljö, tarmflorans, samt generna av intresse. Det rekommenderas att utföra en pilot experiment med ett litet antal möss att testa olika doser och behandlingstider DSS administration. Under pilot experiment…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds genom bidrag från de nationella naturvetenskap Foundation of China (81671016, 31471008 och 31661143030) och National Institutes of Health (DC010012, DC015819) och av stiftelsen Siyuan.
Materials
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. | ||
Referências
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory Bowel Disease. Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).
- Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).
- Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases. Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Gilbertson, T. A., Khan, N. A. Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges. Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).
- Huang, L., et al. Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).
- Perez, C. A., et al. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).
- Shigemura, N., Ninomiya, Y. Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying. International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).
- Bezençon, C., et al. Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells. Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).
- Lu, P., Zhang, C. -. H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. Extraoral bitter taste receptors in health and disease. The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104 (25), (2014).
- Feng, P., et al. Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin. Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).
- Feng, P., et al. Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).
- Axelsson, L. -. G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -. C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).
- Egger, B., et al. Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency. Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
