यह लेख एक तीन आयामी (3 डी) थाइमिक संस्कृति प्रणाली द्वारा ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न थाइमिक उत्प्रवासियों (iTE) उत्पन्न करने के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन करता है। iTE टी कोशिकाओं का एक समरूप सबसेट बारीकी से प्रसार के लिए क्षमता के साथ भोले टी कोशिकाओं से संबंधित हैं, स्मृति गठन, और ट्यूमर दमन.
पूर्व-व्यवस्थित टी सेल रिसेप्टर्स (टी.सी.आर.) और उनके एपिजेनेटिक कायाकल्प की विरासत प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) व्युत्पन्न टी कोशिकाओं दत्तक टी सेल थेरेपी (ACT) के लिए एक आशाजनक स्रोत बनाते हैं। हालांकि, iPSC से पुनर्जीवित टी कोशिकाओं के उत्पादन के लिए शास्त्रीय इन विट्रो विधियों में या तो सहज की तरह या अंत में विभेदित टी कोशिकाओं, जो phenoआमरूपऔर और कार्यात्मक भोले टी कोशिकाओं से अलग कर रहे हैं में परिणाम. हाल ही में, एक उपन्यास तीन आयामी (3 डी) थाइमिक संस्कृति प्रणाली CD8 के एक समरूप सबसेट उत्पन्न करने के लिए विकसित किया गया था– + एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के साथ एक भोले टी सेल की तरह कार्यात्मक phenotype, प्रसार के लिए क्षमता सहित, स्मृति गठन , और विवो में ट्यूमर दमन. इस प्रोटोकॉल aberant विकास भाग्य से बचा जाता है, नैदानिक रूप से प्रासंगिक iPSC व्युत्पन्न टी कोशिकाओं के उत्पादन के लिए अनुमति देता है, iPSC व्युत्पन्न थाइमिक उत्प्रवासियों (iTE) के रूप में नामित है, जबकि यह भी बाद के कार्यों को स्पष्ट करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करने के लिए आवश्यक थाइमिक चयन के बाद टी सेल परिपक्वता के लिए.
दत्तक टी सेल थेरेपी (ACT) उन्नत कैंसर के साथ कुछ रोगियों के लिए एक प्रभावी उपचार हो सकता है. दुर्भाग्य से, कई रोगियों ट्यूमर प्रतिगमन का अनुभव नहीं है, और स्थानांतरित कोशिकाओं जलसेक के बाद जारी रखने के लिए असफल। यह संचार टी कोशिकाओं की गुणवत्ता के कारण हो सकता है। एक अधिनियम माउस मॉडल से पता चला है कि भोले या कम विभेदित केंद्रीय स्मृति टी कोशिकाओं की तुलना में, टर्मिनल विभेदित effector कोशिकाओं vivo हठ1में गरीब के कारण कम शक्तिशाली हैं , एक अवलोकन भी नैदानिक डेटा द्वारा समर्थित2, 3.
वर्तमान अधिनियम की प्रभावकारिता में सुधार करने के प्रयास में, टी सेल व्युत्पन्न प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (टी-iPSC) बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है4,5. जब टी कोशिकाओं T-iPSC में reprogrammed और टी कोशिकाओं में फिर से अलग कर रहे हैं, TCR जीन का पुनर्व्यवस्थित विन्यास टी-iPSC द्वारा विरासत में मिला है, और बाद में फिर से अलग टी कोशिकाओं. इसलिए, टी-आईपीएससी की क्षमता इन विट्रो विस्तार में असीमित से गुजरना करने के लिए अपरिपक्व टी कोशिकाओं के कुशल प्रजनन neoantigen-विशिष्ट टी सेल रिसेप्टर्स ले जाने की अनुमति देता है जब ऐसी कोशिकाओं ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं से इंजीनियर हैं6 ,7. हालांकि, परिपक्व टी कोशिकाओं में टी-आईपीएससी के भेदभाव के लिए सटीक विधि, जो कम विभेदित फीनोटाइप और बेहतर एंटी-ट्यूमर शक्ति के साथ कैंसर प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के उत्पादन की अनुमति देगा, स्पष्ट किया जा करने के लिए रहता है।
टी-आईपीएससी विभेदन ओपी 9 में यूरीन स्ट्रॉमल कोशिकाओं के सह-संवर्धन को नियोजित करता है, जो मानव पायदान लिगंड डीएलएल 1 को अधिक व्यक्त करता है, यह इन विट्रो6,7में टी कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए एक सुस्थापित विधि है। चूहों और मनुष्यों में, यह सह-संस्कृति प्रणाली लगातार आईपीएससी में अंतर कर सकती है, जिससेविकास की घटनाओं को ब्लास्टोसिस्ट चरण से तब तक पुन: लागू किया जा सकता है जब तक कि अपरिपक्व टी सेल वंश चरण 6,7तक। इन जैव प्रौद्योगिकी प्रगति के बावजूद, CD4+CD8+ डबल सकारात्मक (डीपी) चरण के बाद शारीरिक भेदभाव अभी भी प्राप्त करने के लिए मुश्किल है. कारणों में से एक यह है कि विवो CD4+CD8में – और CD4–CD8+ एकल सकारात्मक (एसपी) टी कोशिकाओं थाइमस में उत्पन्न कर रहे हैं, परिपक्वता और टी कोशिकाओं है कि विदेशी प्रतिजन विशिष्टता के चयन के लिए जिम्मेदार एक अंग लेकिन नहीं ऑटो प्रतिक्रिया8| इन चयनात्मक प्रक्रमों को क्रमशः धनात्मक तथा ऋणात्मक चयन के रूप में परिभाषित किया जाता है। हालांकि, थाइमस में टी कोशिकाओं को परिपक्व करने के लिए आवश्यक अधिकांश आणविक तंत्र अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं, जिससे इन विट्रो में इस प्रक्रिया को फिर से बनाना मुश्किल हो गया है। इस शारीरिक बाधा को दूर करने के प्रयास में, कई समूहों ने एंटी-सीडी 3 एंटीबॉडी या एगोनिस्ट पेप्टाइड्स का उपयोग करके टीसीआर परिसर को प्रेरित किया है। इन इन इन इन इन सेल उत्पादों को उत्पन्न करते हैं जो कुंजी टी सेल मार्करों को व्यक्त करते हैं, जैसे CD3, CD8,TCR], और CD62L, जबकि अभी भी ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्टता को बनाए रखने. दुर्भाग्य से, टी कोशिकाओं इन extrathymic तरीकों से उत्पन्न अपूर्ण सकारात्मक चयन, सहज की तरह सुविधाओं, टीसीआर गैर विशिष्ट हत्या, स्मृति गठन के लिए असमर्थता, और की विशेषता कोशिकाओं की एक व्यापक विषमजात आबादी का गठन विवो8,9,10,11में गैर-निरंतर एंटी-ट्यूमर प्रभाव । इन असामान्यताओं चिंताओं उठाया है कि ऐसी कोशिकाओं के साइड इफेक्ट की एक किस्म को गति प्रदान कर सकते हैं, लिंफोमा और दोनों त्वचा और हड्डी असामान्यताएं सहित, अगर चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया12,13,14 .
इन विट्रो विभेदन प्रणालियों में वर्तमान में लापता शारीरिक संकेतों को विश्राम करने के लिए, ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट टी-आईपीएससी को काटा गया थाइमस का उपयोग करके विभेदित किया गया था। शास्त्रीय भ्रूण थाइमस अंग संस्कृति (FTOC) प्रणाली है, जो टी कोशिकाओं के अंतर-थाइमिक विकास का अध्ययन करने के लिए डिजाइन किया गया था, एक 3 डी संस्कृति प्रणाली है जो सफलतापूर्वक टी कोशिकाओं है कि थाइमिक शिक्षा पूरा का उत्पादन का उपयोग करके सुधार किया गया था। इन पोस्ट-थाइमिक टी सेल, जिन्हें आईपीएसएससी व्युत्पन्न थाइमिक उत्प्रवासियों (आईआईटीई) के रूप में नामित किया गया था, ने भोले-समान गुणों का प्रदर्शनकिया। iTE स्थापित B16 मेलेनोमा ट्यूमर के खिलाफ एक माउस मॉडल में प्रसार, स्मृति गठन, और पर्याप्त विरोधी ट्यूमर प्रभाव दिखाया. यह आलेख 3D संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके इस उपन्यास FTOC प्रणाली के प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करता है (चित्र1)।
ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं को पुनर्जीवित करने के लिए टी-iPSC का उपयोग बेहतर दृढ़ता के साथ युवा कोशिकाओं पैदा करके अधिनियम की वर्तमान बाधाओं के कई दूर हो सकता है। हालांकि OP9/DLL1 सह संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर कई तरीकों CD8 सपा कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए सूचित किया गया है6,7,10,13 कि व्यक्त CD8 अणुओं और ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट TCRs, वैश्विक जीन अभिव्यक्ति पैटर्न और कार्यात्मक विश्लेषण से पता चलता है कि इन extrathymically पुनर्जीवित CD8 सपा कोशिकाओं भोले टी कोशिकाओं से अलग हैं (चित्र 4). यहाँ, हम एक 3 डी थाइमिक संस्कृति प्रणाली है कि iPSC व्युत्पन्न थाइमिक उत्प्रवासियों (iTE) murine टी-iPSC से उच्च निष्ठा और एकरूपता के साथ उत्पन्न कर सकते हैं का वर्णन. iTE वैश्विक जीन अभिव्यक्ति पैटर्न में और कार्यक्षमता में भोले टी कोशिकाओं के समान है, इस तरह के स्मृति गठन के रूप में और स्थापित ट्यूमर के खिलाफ विवो विरोधी ट्यूमर प्रभाव में15.
शास्त्रीय FTOC प्रणाली इन विट्रो मेंथाइमिक चयन को पुन: दोहराने का एक तरीका है . इसका उपयोग थाइमोसाइट्स23के अंतर-थाइमिक विकास के अध्ययन के लिए किया गया है और एफ टी ओ सी के कुछ रिपोर्टें हैं जिनका उपयोग आरटीई24उत्पन्न करने के लिए किया जा रहा है . हालांकि, FTOC सिस्टम कई सीमाएँ हैं। कृत्रिम अंग संस्कृति में ऑक्सीजन की कमी से निपटने के लिए, कई समूहों ने या तो अर्ध शुष्क झिल्ली आधारित संस्कृति23या उच्च ऑक्सीजन पनडुब्बी संस्कृति प्रणालियों25का उपयोग किया है। हालांकि, कोई वर्तमान तरीकों लगातार पोस्ट-थाइमिक टी कोशिकाओं की एक समरूप आबादी उत्पन्न कर सकते हैं। शास्त्रीय FTOC प्रणाली की सीमाओं को दूर करने के लिए, हम एक 3 डी थाइमिक संस्कृति प्रणाली है कि पारंपरिक तरीकों15पर तकनीकी सुधार प्रदान करता है डिजाइन . उदाहरण के लिए, हमारे 3 डी थाइमिक संस्कृति विधि का उपयोग कर, अधिकतम ऑक्सीजन विनिमय और सतह-लोब यांत्रिक तनाव की अनुपस्थिति एक अधिक शारीरिक वातावरण में थाइमिक lobes रहते हैं. इसके अतिरिक्त, दीर्घकालिक संस्कृति परिपक्व टी कोशिकाओं को थाइमिक लोब से स्वाभाविक रूप से बाहर होने की अनुमति देती है। अंत में, वास्तविक समय अवलोकन और सूक्ष्म हेरफेर मीडिया विनिमय और शारीरिक रूप से थाइमिक lobes परेशान बिना iTE का एक निरंतर संग्रह सक्षम करें. इस प्रकार, 3 डी थाइमिक संस्कृति विधि महत्वपूर्ण तकनीकी सुधार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक अवसर के लिए thymically चयनित भोले टी कोशिकाओं है कि पहले से उपलब्ध नहीं था अध्ययन प्रदान करता है.
इस 3 डी थाइमिक संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर iTE की सफल पीढ़ी के लिए कई महत्वपूर्ण बिंदु हैं। आईपीएससी विभेदन का समर्थन करने की क्षमता खोए बिना ओपी9/डीएलएल1 कोशिकाओं के विस्तार को बनाए रखने के लिए एफबीएस और संस्कृति की स्थितियों की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है। इसलिए, हम FBS बहुत के पूर्व मूल्यांकन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लगातार 80% संगम पर passaging सेल भेदभाव और जीर्णता को रोकने के लिए सलाह देते हैं. इसके अतिरिक्त, एक confluent OP9/DLL1 संस्कृति अपरिपक्व टी कोशिकाओं में iPSC के विट्रो भेदभाव के लिए आवश्यक है, के रूप में संगम में मतभेद उनकी दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं. अंत में, थाइमिक lobes के भ्रूण उम्र iTE की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण है. हम E14.5 – 15.5 थाइमिक lobes का उपयोग करने की सलाह देते हैं.
किसी भी नए प्रोटोकॉल के साथ के रूप में, इस विधि सीमाओं है और सुधार के अधीन है. यहाँ प्रस्तुत संस्कृति तकनीक दो सप्ताह की अवधि के लिए प्रति दिन लगभग 1000 iTE प्रति थाइमिक पालि उत्पन्न करता है. बढ़ी हुई iTE पीढ़ी आगे संशोधनों के साथ संभव हो सकता है, ऑक्सीजन एकाग्रता के अनुकूलन सहित, मीडिया की मात्रा, और 3 डी संस्कृति प्लेट के प्रकार. इसके अलावा या cytokines को हटाने, साथ ही cytokine एकाग्रता में परिवर्तन, भी सुधार iTE उपज में योगदान कर सकते हैं.
यह देखते हुए कि 3 डी थाइमिक संस्कृति प्रणाली यहाँ प्रस्तुत एक पूरी तरह से पूर्व vivo प्रणाली में थाइमिक उत्प्रवासियों उत्पन्न कर सकते हैं, इस तकनीक सहित प्रतिरक्षा और दत्तक सेल हस्तांतरण अनुसंधान परियोजनाओं की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन टी तक ही सीमित नहीं कोशिका विभेदन, पश्च-थाइमिक टी कोशिका परिपक्वता, और हेमेटोपोएटिक संतति या स्टेम कोशिकाओं से प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं का उत्पादन। हालांकि इस विधि सीधे मानव नमूनों के लिए लागू नहीं है, आईटीई और 3 डी थाइमिक संस्कृति प्रणाली सकारात्मक और नकारात्मक चयन के आणविक तंत्र स्पष्ट करने के लिए महान क्षमता पकड़ और एक संस्कृति प्रणाली है कि सक्षम बनाता है के निर्माण की सुविधा हो सकती है अधिनियम के लिए नैदानिक रूप से प्रासंगिक ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट भोले-जैसे टी कोशिकाओं की पीढ़ी।
The authors have nothing to disclose.
हम कृपया OP9/DLL1 सेल लाइन प्रदान करने के लिए हिरोशी Kawamoto और Kyoko Masuda धन्यवाद. हम एलन बी Hoofring और Erina ] धन्यवाद. वह आलेखी सहायता के लिए। इस शोध अमेरिका के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान के Intramural अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था (ज़िया BC010763) और एनसीआई, NIH में सेल आधारित थेरेपी के लिए केंद्र के लिए कैंसर Moonshot कार्यक्रम. काम भी Milstein परिवार फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था.
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
2-deoxyguanosine | Sigma-Aldrich | 312693-72-4 | |
2-Mercaptoethanol (1000X) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | R21001 | |
FBS | Gemini | 100-500 | |
Flt-3 ligand | R&D Systems | 427-FL | |
GlutaMAX (100X) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
hgp100 | Genscript | 282077-1, KVPRNQDWL | |
Interleukin-2 | R&D Systems | 402-ML | |
Interleukin-7 | R&D Systems | 407-ML | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
MEM powder | Gibco | 61100061 | |
Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | |
Nucleoprotein | Global Peptides | ASNENMETM | |
Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
Stem Cell Factor (SCF) | R&D Systems | 455-MC | |
Stemfactor LIF, Mouse Recombinant | STEMGENT | 03-0011-100 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 | |
Cell Culture Vessels and others | |||
10 cm dish | Corning, Inc. | 353003 | |
12ML Syringe | Covidien Monoject | 22-652-090 | |
6 well plate | Corning/Coster | 3516 | |
Cell strainer 100um | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
Cell strainer 40um | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
Forceps | DUMONT | 0108-5PO | |
Lab soaker mat | Versi-Dry | Cat. EF2175CX 74018-00 | |
Membrane filters ( 0.8 μm, 47diam) | Whatman | WHA7408004 ALDRICH | |
Perfecta3D Hanging Drop Plate | Sigma-Aldrich | HDP1096 | |
U Bottom 96 well plate | Corning/Coster | 3799 | |
Experimental Cell lines | |||
CD3-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
MEF-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | ATCC | SCRC-1040; RRID:MGI:5007926 | |
OP9/N-DLL1 | Riken Bioresource center | Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 | |
Pmel-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
Experimental mouse models | |||
B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl | Charles River | Strain Code 564; RRID:IMSR_CRL:564 | |
C57BL/6N | NCI/Charles River | N/A | |
Pmel-1 mice | Overwijk et al. | J Exp Med 198(4):569-80 | |
Antibodies | |||
Anti-aTCR | Biolegend | 109202; RRID:AB_313425 | |
Anti-CD3 | abcam | ab11089; RRID:AB_369097 | |
Anti-CD4 | BD Biosciences | 553730; RRID:AB_395014 | |
Anti-CD44 | BD Biosciences | 559250; RRID:AB_398661 | |
Anti-CD45.1 | BD Biosciences | 553775; RRID:AB_395043 | |
Anti-CD45.2 | BD Biosciences | 553772; RRID:AB_395041 | |
Anti-CD62L | BD Biosciences | 560516; RRID:AB_1645257 | |
Anti-CD69 | BD Biosciences | 552879; RRID:AB_394508 | |
Anti-CD8a | BD Biosciences | 557959; RRID:AB_396959 | |
Anti-CD8b | BD Biosciences | 550798; RRID:AB_393887 | |
Anti-H-2Kb | BD Biosciences | 553570; RRID:AB_394928 | |
Anti-IFN-g | BD Biosciences | 557998; RRID:AB_396979 | |
Anti-IL-2 | BD Biosciences | 554428; RRID:AB_395386 | |
Anti-TCRb | Thermo Fisher Scientific | 35-5961-81; RRID:AB_469741 | |
Anti-TCRVb13 | BD Biosciences | 553204; RRID:AB_394706 | |
Anti-TNFa | BD Biosciences | 557644; RRID:AB_396761 |