Denne artikkelen beskriver en ny metode for å generere tumor antigen-spesifikke indusert pluripotent stilk cellen avledet tymusatrofi nybyggere (iTE) av en tre-dimensjonale (3D) tymusatrofi kultur system. iTE er en homogen undergruppe av T-celler nært knyttet til naive T-celler med kapasitet for spredning, minne formasjon, og tumor undertrykkelse.
Arven etter pre-omorganisert T celle reseptorer (TCRs) og deres epigenetic foryngelse gjøre indusert pluripotent stilk cellen (iPSC)-avledet T celler en lovende kilde for adoptivforeldre T celle terapi (ACT). Men, klassisk in vitro metoder for å produsere generert T-celler fra iPSC resultere i enten medfødt-like eller uhelbredelig differensiert T-celler, som er phenotypically og funksjonelt skiller fra naive T-celler. Nylig, en roman tredimensjonale (3D) tymusatrofi kultur system ble utviklet for å generere en homogen undergruppe av CD8αβ+ antigen-spesifikke T-celler med en naiv t celle-lignende funksjonell fenotype, inkludert kapasitet for spredning, minne formasjon , og tumor undertrykkelse in vivo. Denne protokollen unngår avvikende utviklingsmessige skjebne, noe som åpner for generering av klinisk relevante iPSC-avledede T-celler, utpekt som iPSC-avledet tymusatrofi nybyggere (iTE), samtidig som det gir et potent verktøy for å belyse de påfølgende funksjonene som er nødvendige for T celle modning etter tymusatrofi utvalg.
Adoptiv T celle terapi (ACT) kan være en effektiv behandling for noen pasienter med avansert kreft. Dessverre, mange pasienter ikke opplever tumor regresjon, og overførte celler ikke klarer å vedvare etter infusjon. Dette kan skyldes kvaliteten på de tilført T-cellene. En ACT musemodell viste at i forhold til naiv eller mindre differensiert sentrale minnet T-celler, uhelbredelig differensiert Effektor celler er mindre potente på grunn av dårlig in vivo utholdenhet1, en observasjon også støttet av kliniske data2, 3i denne.
I et forsøk på å forbedre effekten av dagens Act, t celle-avledet indusert Pluripotent stamceller (t-IPSC) har blitt studert omfattende4,5. Når T-celler er omprogrammeres i T-iPSC og re-differensiert i T-celler, den omorganisert konfigurasjon av TCR gener er arvet av T-iPSC, og deretter re-differensiert T-celler. Derfor er kapasiteten til T-iPSC å gjennomgå ubegrenset in vitro ekspansjon tillater effektiv reproduksjon av umodne T celler bærer neoantigen-spesifikke T celle reseptorer (TCR) når slike celler er konstruert fra tumor antigen-spesifikke T-celler6 ,7. Men den presise metoden for differensiering av T-iPSC i modne T-celler, som ville tillate produksjon av kreft antigen-spesifikke T-celler med en mindre differensiert fenotype og bedre anti-tumor potens, gjenstår å belyst.
T-IPSC differensiering ansette co-kulturen i OP9 murine stromal celler over-uttrykker menneskelig hakk ligand DLL1 er en veletablert metode for å produsere T celler in vitro6,7. I mus og mennesker, kan dette co-kultur systemet konsekvent differensiere IPSC, og dermed recapitulating utviklingsmessige hendelser fra blastocyst scenen til umodne T Cell Lineage trinn6,7. Til tross for disse bioteknologisk fremskritt, den fysiologiske differensiering etter CD4+CD8+ Double positive (DP) scenen er fortsatt vanskelig å oppnå. En av grunnene er at in vivo CD4+CD8-og CD4–CD8+ singel positive (SP) T– celler er generert i thymus, et organ ansvarlig for modning og valg av T-celler som har utenlandsk antigen-spesifisitet, men ikke automatisk reaktivitet8. Disse selektive prosessene defineres som henholdsvis positive og negative valg. Men de fleste av de molekylære mekanismer som er nødvendig for å modne T celler i thymus er fortsatt ikke fullt ut forstått, noe som gjør det vanskelig å rekonstruere denne prosessen in vitro. I et forsøk på å overvinne denne fysiologiske hinderet, har flere grupper stimulert av TCR komplekse ved hjelp av anti-CD3 antistoffer eller Agonistiske peptider. Disse in vitro teknikker generere celle produkter som uttrykker nøkkel T celle markører, som CD3, CD8αβ, TCRαβ, og CD62L, mens du fortsatt beholde tumor antigen-spesifisitet. Dessverre, T-celler generert av disse extrathymic metoder utgjør en bred heterogene befolkning av celler preget av ufullstendige positive valg, medfødt-lignende funksjoner, TCR ikke-spesifikk drap, manglende evne til minne formasjon, og ikke-vedvarende anti-tumor effekter i vivo8,9,10,11. Disse unormalt har reist bekymring for at slike celler kan utløse en rekke bivirkninger, inkludert lymfom og både hud og bein unormalt, hvis det brukes for terapeutiske programmer12,13,14 .
For å gjenskape de fysiologiske signalene som mangler i gjeldende in vitro differensiering systemer, tumor antigen-spesifikke T-iPSC ble differensiert ved hjelp av en høstet thymus. Den klassiske fosterets thymus organ kultur (FTOC) system, som ble utviklet for å studere intra-tymusatrofi utvikling av T-celler, ble forbedret ved hjelp av en 3D-kultur system som vellykket produserte T-celler som fullførte tymusatrofi utdanning. Disse post-tymusatrofi T-celler, som ble utpekt som iPSC-avledet tymusatrofi nybyggere (iTE), utstilt naiv-lignende egenskaper15. iTE viste spredning, minne formasjon, og tilstrekkelig anti-tumor effekter i en musemodell mot etablerte b16 melanom svulster. Denne artikkelen beskriver i detalj protokollen av denne romanen FTOC systemet ved hjelp av en 3D-kultur system (figur 1).
Bruke T-iPSC å regenerere tumor antigen-spesifikke T-celler kan overvinne mange av dagens hindringer ACT ved å generere små celler med forbedret utholdenhet. Selv om flere metoder bruker OP9/DLL1 co-kultur systemet har blitt rapportert å generere CD8 SP celler6,7,10,13 som uttrykker CD8 molekyler og tumor antigen-spesifikke TCRs, global Gene uttrykks mønstre og funksjonell analyse viser at disse extrathymically generert CD8 SP-celler er forskjellige fra naive T-celler (Figur 4). Her beskriver vi et 3D tymusatrofi kultur system som kan generere iPSC-avledede tymusatrofi nybyggere (iTE) med høy troskap og homogenitet fra murine T-iPSC. iTE ligne naiv T-celler i globale genet uttrykk mønster og i funksjonalitet, for eksempel minne formasjon og in vivo anti-tumor effekt mot etablerte tumor15.
Den klassiske FTOC systemet er en måte å recapitulate tymusatrofi utvalg in vitro. Det har vært brukt for å studere intra-tymusatrofi utvikling av thymocytes23, og det er noen rapporter om FTOC brukes til å generere RTE24. FTOC-systemet har imidlertid flere begrensninger. For å håndtere mangelen på oksygen i en kunstig organ kultur, flere grupper har brukt enten en semi-tørr membran basert kultur23, eller høy oksygen nedsenking kultur systemer25. Men ingen aktuelle metoder kan stadig generere en homogen befolkning på post-tymusatrofi T-celler. For å overkomme begrensningene i det klassiske FTOC-systemet, utviklet vi et 3D-tymusatrofi kultur system som gir tekniske forbedringer i forhold til konvensjonelle metoder15. For eksempel, ved hjelp av vår 3D tymusatrofi kultur metode, maksimal oksygen utveksling og fravær av overflate-flik mekanisk stress holde tymusatrofi fliker i et mer fysiologisk miljø. I tillegg langsiktig kultur tillater eldre T-celler til utgående naturlig fra tymusatrofi fliker. Endelig sanntid observasjon og mikro-manipulasjon aktivere Media utveksling og en konstant samling av iTE uten fysisk forstyrrer tymusatrofi fliker. Således, det 3D tymusatrofi kulturen metoden skaffer betydelig teknisk forbedringer likeledes idet en allé å studere thymically valgt naiv T-celler det var ikke tidligere anvendelig.
Det er flere viktige punkter for den vellykkede generasjonen av iTE bruker denne 3D tymusatrofi kultur system. Kvaliteten på FBS og kultur forhold er avgjørende for å opprettholde utvidelsen av OP9/DLL1 celler uten å miste sin evne til å støtte iPSC differensiering. Derfor anbefaler vi forhånds evaluering av FBS mye samt gjennomgående passaging på 80% confluency for å hindre celle differensiering og senescence. I tillegg er en confluent OP9/DLL1 kultur kreves for in vitro differensiering av IPSC i umodne T-celler, som forskjeller i confluency kan påvirke deres effektivitet. Endelig er den embryonale alder av tymusatrofi fliker avgjørende for generering av iTE. Vi anbefaler å bruke E 14.5-15,5 tymusatrofi fliker.
Som med alle nye protokoller, denne metoden har begrensninger og er gjenstand for forbedring. Kulturen teknikken presenteres her genererer ca 1000 iTE per tymusatrofi flik per dag for en periode på to uker. Økt iTE-generering kan være mulig med ytterligere modifikasjoner, inkludert optimalisering av oksygen konsentrasjon, medie volum og type 3D-kultur plate. Addisjon eller flytting av cytokiner, likeledes idet endre inne cytokin konsentrasjonen, kunne også levere å forbedret iTE utbytte.
Gitt at 3D tymusatrofi kultur system som presenteres her kan generere tymusatrofi nybyggere i et helt ex vivo -system, kan denne teknikken brukes til en rekke immunologiske og adoptiv celle overføring forskningsprosjekter inkludert, men ikke begrenset til T celle differensiering, post-tymusatrofi T celle modning, og generering av antigen-spesifikke T-celler fra blodkreft stamfar eller stamceller. Selv om denne metoden ikke er direkte anvendelig på menneskelige prøver, iTE og 3D-tymusatrofi kultur system holder stort potensial for elucidating den molekylære mekanismer av positive og negative valg og kan forenkle opprettelsen av et kultur system som gjør generering av klinisk relevant tumor antigen-spesifikke naiv-lignende T-celler for ACT.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Hiroshi Kawamoto og Kyoko Masuda for vennlig å gi OP9/DLL1 cellelinje. Vi takker Alan B. Hoofring og Erina Z. Han for grafisk assistanse. Denne forskningen ble støttet av intramural forsknings program for det amerikanske National Cancer Institute (ZIA BC010763) og kreft Moonshot program for Center for Cell-based Therapy ved NCI, NIH. Verket ble også støttet av Milstein Family Foundation.
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
2-deoxyguanosine | Sigma-Aldrich | 312693-72-4 | |
2-Mercaptoethanol (1000X) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | R21001 | |
FBS | Gemini | 100-500 | |
Flt-3 ligand | R&D Systems | 427-FL | |
GlutaMAX (100X) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
hgp100 | Genscript | 282077-1, KVPRNQDWL | |
Interleukin-2 | R&D Systems | 402-ML | |
Interleukin-7 | R&D Systems | 407-ML | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
MEM powder | Gibco | 61100061 | |
Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | |
Nucleoprotein | Global Peptides | ASNENMETM | |
Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
Stem Cell Factor (SCF) | R&D Systems | 455-MC | |
Stemfactor LIF, Mouse Recombinant | STEMGENT | 03-0011-100 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 | |
Cell Culture Vessels and others | |||
10 cm dish | Corning, Inc. | 353003 | |
12ML Syringe | Covidien Monoject | 22-652-090 | |
6 well plate | Corning/Coster | 3516 | |
Cell strainer 100um | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
Cell strainer 40um | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
Forceps | DUMONT | 0108-5PO | |
Lab soaker mat | Versi-Dry | Cat. EF2175CX 74018-00 | |
Membrane filters ( 0.8 μm, 47diam) | Whatman | WHA7408004 ALDRICH | |
Perfecta3D Hanging Drop Plate | Sigma-Aldrich | HDP1096 | |
U Bottom 96 well plate | Corning/Coster | 3799 | |
Experimental Cell lines | |||
CD3-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
MEF-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | ATCC | SCRC-1040; RRID:MGI:5007926 | |
OP9/N-DLL1 | Riken Bioresource center | Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 | |
Pmel-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
Experimental mouse models | |||
B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl | Charles River | Strain Code 564; RRID:IMSR_CRL:564 | |
C57BL/6N | NCI/Charles River | N/A | |
Pmel-1 mice | Overwijk et al. | J Exp Med 198(4):569-80 | |
Antibodies | |||
Anti-aTCR | Biolegend | 109202; RRID:AB_313425 | |
Anti-CD3 | abcam | ab11089; RRID:AB_369097 | |
Anti-CD4 | BD Biosciences | 553730; RRID:AB_395014 | |
Anti-CD44 | BD Biosciences | 559250; RRID:AB_398661 | |
Anti-CD45.1 | BD Biosciences | 553775; RRID:AB_395043 | |
Anti-CD45.2 | BD Biosciences | 553772; RRID:AB_395041 | |
Anti-CD62L | BD Biosciences | 560516; RRID:AB_1645257 | |
Anti-CD69 | BD Biosciences | 552879; RRID:AB_394508 | |
Anti-CD8a | BD Biosciences | 557959; RRID:AB_396959 | |
Anti-CD8b | BD Biosciences | 550798; RRID:AB_393887 | |
Anti-H-2Kb | BD Biosciences | 553570; RRID:AB_394928 | |
Anti-IFN-g | BD Biosciences | 557998; RRID:AB_396979 | |
Anti-IL-2 | BD Biosciences | 554428; RRID:AB_395386 | |
Anti-TCRb | Thermo Fisher Scientific | 35-5961-81; RRID:AB_469741 | |
Anti-TCRVb13 | BD Biosciences | 553204; RRID:AB_394706 | |
Anti-TNFa | BD Biosciences | 557644; RRID:AB_396761 |