전체-마운트 얼룩을 사용 하 여 3D 백색 지방 조직 구조의 시각화

Summary

현재 연구의 초점은 지방 조직 아키텍처와 세포 구성의 3D 영상에 대 한 이상적인 방법으로 전체-마운트 immunostaining 및 시각화 기법을 설명 하.

Abstract

지방이 많은 직물은 높은 소성으로 중요 한 변화 기관 이다 이며 환경 자극 및 영양 상태에 반응. 따라서, 다양 한 기법 형태학 및 지방이 많은 직물의 생물학 연구 개발 되었습니다. 그러나, 기존의 시각화 방법을 공부 전체 기관의 3D 아키텍처를 캡처를 2D의 섹션에서 조직으로 제한 됩니다. 여기에 우리가 전체-마운트 현재 얼룩, 최소한의 처리 단계를 그대로 지방 조직 형태를 유지 하는 immunohistochemistry 메서드. 따라서, adipocytes 및 다른 세포 구성 성분의 구조는 조직의 가장 대표적인 3D 시각화를 달성 하는 왜곡 없이 유지 됩니다. 또한, 전체 마운트 얼룩 세포 운명 결정을 결정 하는 계보 추적 방법 결합할 수 있습니다. 그러나,이 기술은 지방이 많은 직물의 더 깊은 부분에 관한 정확한 정보를 제공 하는 몇 가지 제한이 있습니다. 이 한계를 극복 하기 위해 전체 산 얼룩이 지 수 추가와 결합 될 조직 기법 조직의 불투명 함 제거 하 고 빛-시트 형광 현미경을 사용 하 여 전체 지방 조직 해부학의 완전 한 시각화에 대 한 허용을 삭제. 따라서, 더 높은 해상도 지방 조직 구조의 더 정확한 표현을 이러한 기술의 조합으로 캡처할 수 있습니다.

Introduction

지방 조직 에너지 저장에 대 한 필수적인 장기 이며 동적 개장 및 거의 무제한 확장¹특징 이다. 에너지 항상성, 지방 조직 또한 담당 한다 필수적인 역할 50 adipokines²전체 신체 신진 대사 기능 조절 하는 호르몬 분 비에. 지방 조직 성숙 adipocytes, 섬유 아 세포, 내 피 세포, 면역 세포, 및 체형 조상 세포³를 포함 하 여 다양 한 세포 유형의 다양 한 아키텍처 구성 하고있다. 최근 연구는 비만 다른 대사 장애 크게 변경할 수 지방 조직 기능 및 그것의 microenvironment, 포함 하지만 adipocytes, 염증 세포의 침투의 확대에 국한 되지 않습니다 (예: 대 식 세포), 및 관 역 기능³.

조직학, cryosectioning 등 기존의 형태학 기법 설명 조직 수축 및 구조 왜곡^{3로 이어질 수 있는 긴 화학 처리 단계와 같은 많은 생물학을 공부 하 고 몇 가지 제한 4}. 또한, 이러한 2D 기술을 얻은 섹션은 전체 조직을³의 작은 지역에 한정 된 다른 세포 유형에 의해 발휘 된 세포 상호 작용을 관찰 충분 하지 않습니다. 기존에 비해 형광 이미징 방법, 전체 마운트 얼룩 단계가 필요 없습니다 추가 침략, 등 포함, 단면, 탈수; 따라서,이 항 체 특이성을 감소의 문제를 방지 합니다. 이와 같이, 체형 형태 및 전반적인 지방 조직 구조⁵의 더 나은 보존 이미징 지방 조직에 대 한 간단 하 고 효율적인 방법입니다. 따라서, 전체 마운트 얼룩으로 신속 하 고 저렴 한 immunolabeling 기법 지방 조직 3D 아키텍처^1,6,,78을 유지 하기 위해 설립 되었다.

그러나, 전체 마운트 얼룩의 사용과 지방이 많은 직물 형태학의 보존에도 불구 하 고이 기술은 조직의 지질 표면 아래 내부 구조 시각화 수 아니다. 몇몇 최근 연구^9,10 조직 지방 조직 내에서 포괄적인 3D 시각화 수 있도록 전체 마운트 immunolabeling^1,6 와 결합 하는 기법을 삭제를 설립 했다. 특히, 조밀한 신경 및 맥 관 구조 네트워크 최근 연구^9,10,,1112 3D 볼륨 영상과 시각화 했다. 실제로, 다른 생리 적인 조건 하에서 지방 조직의 신경 및 혈관 소성을 공부 하 고 그것의 생물학을 공부 필수적 이다. 솔벤트 허가 기관 (iDISCO +) 조직 비운의 3-차원 영상 Immunolabeling 사용은 비운의 유기 화학 시 약 dichloromethane (DCM와 불투명 함 조직 그리고 메탄올 전처리, immunolabeling의 구성 과정 )와 dibenzyl 에테르 (DBE)^13,14. 지방 조직을 투명 하 게 함으로써, 혈관과 신경 섬유 등 조직 내의 해부학의 더 정확한 표현^9,10얻을 수 있습니다. IDISCO + 장점이 그것은 다양 한 항 체와 형광 기자^11,14, 그리고 여러 장기와 심지어 embryoes¹⁴에서 성공을 보여주었다. 그러나, 그것의 주요 제한은 있는 18 ~ 20 일 전체 실험을 완료 하는 데 필요한 긴 보육 시간입니다.

전체 산 얼룩의 또 다른 중요 한 응용 프로그램 계보 추적 시스템와 함께에서 셀 운명의 시각화 이다. 계보 추적 모든 딸 세포에 전달 될 수 있다 고¹⁵시간 이상 보존 하는 셀에는 특정 유전자/마커 라벨입니다. 따라서, 셀의 자손¹⁵의 운명을 결정 하는 데 사용할 수 있는 강력한 도구입니다. 1990 년대 이후, Cre LoxP 재조합 시스템 생활의 혈통 추적에 대 한 강력한 접근 되고있다 유기 체¹⁵. Cre, DNA recombinase 효소를 표현 하는 마우스 선을 loxP-정지-loxP 시퀀스에 인접 한 기자를 표현 하는 다른 마우스 라인 넘은, 기자 단백질 표현된¹⁵입니다.

전체-마운트 얼룩에 대 한 형광 색 기자 들의 사용은 세포내 활동 체형¹⁶의 최소한의 간섭에 대 한 허용 하기 때문에 지방이 많은 직물의 이미징 적합 합니다. 그러나, 전통적인 기자는 일반적으로 제한 된 세포질 콘텐츠¹⁷흰색 adipocytes의 계보를 추적 하 고 어려운 세포질, 얼룩. 이 문제를 해결 하려면 막 도약 형광 tdTomato/막 eGFP (mT/mG) 기자 마커를 사용 하 여 이상적인 도구입니다. 막-타겟 tdTomato Cre 음수가 셀¹⁸로 표시 됩니다. Cre 절단 시 막 대상 eGFP 식 스위치,이 기자 체형 창시자^17,18 (보충 그림 1)의 계보를 추적에 대 한 적당 한 만드는 발생 합니다.

이 문서의 목적은 전체 마운트 얼룩에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하 고 결합 하 수 다른 기술을 개발 및 지방이 많은 직물의 생리학을 공부 하는 방법을 보여 것입니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 응용 프로그램의 두 가지 예는 1) 멀티 컬러 기자 마우스 라인 adipocytes 2) 조직 흰색 adipose 조직 (WAT)에 신경 arborization 추가 시각화를 비운의 다양 한 출처를 식별 하는 사용.

Protocol

Phenogenomics (TCP) 동물 관리에 캐나다 위원회의 표준 준수에 대 한 모든 실험 동물 프로토콜 센터의 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었다. 마우스 명암 주기 12 h에 유지 하 고 물과 음식에 대 한 무료 액세스와 함께 제공 했다. 7 달 오래 된 C57BL/6J 남성 쥐 전체 마운트 착 실험에 사용 되었다. 참고: 섹션 1 ~ 2 시간 순서 대로, 섹션 3 직후에 제 1 단계는 선택적 되 고 있습니다. 제 4 ?…

Representative Results

지방이 많은 직물의 취약성 때문 방법 여러 처리 단계를 포함 하 고 단면 지방 조직 형태3 (그림 1A)의 외관을 손상 될 수 있습니다. 그러나, 전체 마운트 얼룩 adipocytes, 결과 (그림 1B)의 정확한 해석을 보장의 형태를 보존할 수 있습니다. 지방 조직의 과잉 고정 정착 액을 이용한 autofluorescence 이끌어 낸다. <strong class=…

Discussion

조직학 및 cryosection 같은 기존의 기술을 세포내 구조를 관찰에 대 한 혜택을 제공, 지방 조직 연구, 세포의 3 차원 시각화를 가능 하 게 다른 관점을 제공 합니다 전체 마운트 얼룩 최소한 처리 조직의 아키텍처입니다.

성공적으로 전체 마운트 얼룩을 수행 하기 위해 다음 제안 사항은 고려 사항으로 취해야 한다. 다른 지방 조직 창 고 수 결과가 다양 한 immunostaining; 따라서, 지?…

Materials

LipidTox	Life Technologies	H34477
PECAM-1 primary antibody	Millipore	MAB1398Z(CH)
TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody	Millipore	AB152, AB1542
DAPI stain	BD Pharmingen	564907
Nikon A1R confocal microscope	Nikon		Confocal microscope
Ultramicroscope I	LaVision BioTec		Light sheet image fluorescent microscope
Alexa Fluor secondary antibodies	Jackson ImmunoResearch		Wavelengths 488, 594 and 647 used
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32	BioSciences	553141
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dibenzyl-ether	Sigma-Aldrich	33630
Methanol	Fisher Chemical	A452-1
30% Hydrogen Peroxide	BIO BASIC CANADA INC	HC4060
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Glycine	Sigma-Aldrich	J7126
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
Lectin kit I, fluorescein labeled	VECTOR LABORATORIES	FLK-2100
F4/80	Bio-Rad	MCA497GA
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI	VECTOR LABORATORIES	H-1500
Paraformaldehyde (PFA)
Phosphate Buffer Saline (PBS)
Triton-X
Tween
Animal serum (goat, donkey)