RNA/protein komplekser renset med botin-streptavidin strategi er elut til løsningen under denaturing forhold i et skjema som er uegnet for ytterligere rensing og funksjonell analyse. Her beskriver vi en endring av denne strategien som benytter et foto-cleavable linker i RNA og en mild UV-elueringsrør trinn, gir native og funksjonell RNA/protein komplekser.
I mange år, blitt det eksepsjonelt sterke og raskt dannet samspillet mellom biotin og streptavidin ble benyttet for delvis rensing av biologisk viktig RNA/protein komplekser. Men denne strategien lider en stor ulempe som begrenser dens bredere utnyttelse: biotin/streptavidin samspillet kan brytes under denaturing som også forstyrre integriteten til eluted komplekser, dermed utelukker deres påfølgende funksjonell analyse og/eller ytterligere rensing med andre metoder. I tillegg er eluted prøvene ofte forurenset med bakgrunn proteiner som nonspecifically knytter streptavidin perler, kompliserer analyse av renset komplekser av sølv flekker og massespektrometri. For å overvinne disse begrensningene, vi utviklet en variant av biotin/streptavidin strategi som biotin er knyttet til en RNA substrat via et foto-cleavable linker og komplekser immobilisert på streptavidin perler er selektivt elut til løsningen i en opprinnelige form av langbølget UV, forlater bakgrunn proteiner på perlene. Kortere RNA bindende underlag kan syntetiseres kjemisk biotin og foto-cleavable linker covalently festet til 5 av de mens lengre RNA underlag kan leveres med de to gruppene av et utfyllende oligonucleotide. Disse to varianter av metoden UV-elueringsrør testet for rensing av U7 snRNP avhengig av behandling komplekser som cleave histone pre-mRNAs på 3 slutten og begge viste sammenligne gunstig til andre tidligere utviklet metoder for rensing. UV-elut prøvene inneholdt lett synlig mengder U7-snRNP som var uten større protein forurensninger og egnet for direkte analyse av massespektrometri og funksjonelle analyser. Metoden beskrevet kan lett tilpasses for rensing av andre RNA bindende komplekser og brukes sammen med single – og double-strandet DNA bindende for å rense DNA-spesifikke proteiner og macromolecular komplekser.
I eukaryoter gjennomgå RNA polymerase II-generert mRNA prekursorer (pre-mRNAs) flere modning hendelser i kjernen før de blir fullt funksjonell mRNA maler for proteinsyntese i cytoplasma. En av disse hendelsene er 3 slutten behandling. For de aller fleste av pre-mRNAs innebærer 3 slutten behandling cleavage koblet til polyadenylation. Denne totrinns reaksjon er katalysert av et relativt rikelig kompleks som består av mer enn 15 proteiner1. Dyr replikering-avhengige histone pre-mRNAs behandles på 3 slutten av en annen mekanisme der den sentrale rollen spilles av U7 snRNP, en lav overflod består av U7 snRNA ~ 60 nukleotider og flere proteiner2,3 . U7 snRNA base parene med en bestemt sekvens i histone pre-mRNA og en av underenheter av U7-snRNP gir cleavage reaksjonen, genererer eldre histone mRNA uten en poly(A) hale. 3 slutten behandling av histone pre-mRNA krever også stilk-Loop bindende Protein (SLBP), som binder en bevart stilk-loop ligger over webområdet cleavage og forbedrer rekruttering av U7-snRNP til underlaget2,3. Studier identifisere individuelle komponenter av U7-snRNP har vært utfordrende på grunn av lav konsentrasjon av U7-snRNP i dyreceller og tendensen til komplisert å distansere eller gjennomgå delvis proteolyse under renselsen ved å bruke milde vaskemidler4,5,6, høy salt vasker og/eller flere brukt kromatografiske trinn7,8,9.
Nylig for å bestemme sammensetningen av U7-avhengige produksjonsutstyr, et kort fragment av histone pre-mRNA inneholder biotin 3 eller 5′ ble inkubert med en kjernefysisk ekstrakt og sammensatte komplekser ble tatt på streptavidin-belagt agarose perler5,6,10. Eksepsjonelt sterke samhandling mellom biotin og streptavidin, var proteiner immobilisert på streptavidin perler elut under denaturing forhold ved koking i SDS og analyseres av sølv flekker og massespektrometri. Mens denne enkle tilnærming identifisert en rekke komponenter av U7-snRNP, ga det relativt grov prøver, ofte forurenset med et stort antall bakgrunn proteiner nonspecifically bundet til streptavidin perler, potensielt maskering noen av komponentene produksjonsutstyr og hindre gjenkjenningen på sølv farget gels5,6,10. Viktigere, utelukket denne tilnærmingen også alle funksjonelle studier med isolert materialet og rensing sin videre til homogenitet av flere metoder.
En rekke endringer ble foreslått over tid å ta nesten uhelbredelig natur biotin/streptavidin samhandling, med de fleste av dem blir utformet å enten svekke samspillet eller gi en kjemisk cleavable spacer arm i den biotin inneholder reagenser11,12. Ulempen med alle disse endringene var at reduserer effektiviteten av metoden eller ofte krever ikke-fysiologiske forhold under elueringsrør trinnet, jeopardizing enten integritet eller aktivitet av renset proteiner.
Her beskriver vi en annen tilnærming for å løse iboende problemet av biotin/streptavidin strategi ved hjelp av RNA underlag som biotin er covalently knyttet til 5′ ende via en foto-cleavable 1-(2-nitrophenyl) ethyl moiety som er følsom for lenge bølge UV13,14. Vi testet denne tilnærmingen for rensing av begrensende U7-avhengige behandling maskiner fra Drosophila og pattedyr kjernefysiske ekstrakter15. Etter en kort inkubering av histone pre-mRNA inneholder biotin og foto-cleavable linker med en kjernefysisk ekstrakt, samlet behandling komplekser er immobilisert på streptavidin perler, grundig vasket og forsiktig ut til løsningen i opprinnelig form av 360 nm UV lyseksponering. UV-elueringsrør metoden er svært effektiv, rask og enkel, gir tilstrekkelig mengder U7-snRNP å visualisere komponentene av sliver flekker fra så lite som 100 µL av ekstrakt15. UV-elut materialet er gratis bakgrunn proteiner og egnet for direkte massespektrometri analyse, flere rensing trinnene og enzymatiske analyser. Samme metode kan vedtas for rensing av andre RNA/protein komplekser som krever relativt kort RNA bindende områder. Biotin og foto-cleavable linker kan også covalently knyttes til single – og double-strandet DNA, kan utvide UV-elueringsrør metoden for rensing av ulike DNA/protein komplekser.
Syntese av RNA underlag som inneholder covalently vedlagt biotin og foto-cleavable linker er praktisk bare med sekvensene som ikke overstiger ~ 65 nukleotider, bli dyrt og ineffektivt for betydelig lengre sekvenser. For å løse dette problemet, utviklet vi også en alternativ tilnærming som passer for mye lengre RNA forpliktende mål. I denne tilnærmingen, RNA av alle lengden og nukleotid er generert i vitro med T7 eller SP6 transkripsjon og herdet til en kort utfyllende oligonucleotide som inneholder biotin og foto-cleavable linker nederst 5′ (trans konfigurasjon). Resulterende duplex blir brukt å rense personlige bindende proteiner eller macromolecular komplekser på streptavidin perler følger samme protokollen på RNA substrater som inneholder bilde-cleavable biotin knyttet covalently (cis konfigurasjon). Med denne endringen, kan Foto-cleavable biotin brukes sammen med i vitro generert utskrifter som inneholder hundrevis av nukleotider, utvide UV-elueringsrør metoden for rensing av et bredt utvalg av RNA/protein.
Metoden beskrevet her er enkel og dessuten omfatter et foto-cleavable linker og UV-elueringsrør trinnet avvike ikke fra de vanligste bruke metodene som utnytter den ekstremt sterke vekselvirkningen mellom biotin og streptavidin. UV-elueringsrør trinnet er veldig effektivt, vanligvis ut mer enn 75% av de immobilisert og tilhørende proteiner fra streptavidin perler, etterlot seg en høy bakgrunn av proteiner som nonspecifically binder til perler. Ved å eliminere denne bakgrunnen, gir UV-elueringsrør trinnet bemerkelse…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker våre kolleger og samarbeidspartnere for deres bidrag til vårt arbeid. Denne studien ble støttet av NIH gi GM 29832.
Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |