Singel-steg rening av makromolekylära komplex använder RNA som bifogas Biotin och en foto-cleavable länkare
Summary
RNA och protein komplex renas med hjälp av botin-streptividin strategi elueras lösning under denatureringen förhållanden i en form som är olämpliga för ytterligare rening och funktionell analys. Här beskriver vi en ändring av denna strategi som utnyttjar en foto-cleavable linker i RNA och en mild UV-eluering steg, framställning av infödda och fullt fungerande RNA och protein komplex.
Abstract
Under många år har exceptionellt starkt och snabbt bildade samspelet mellan biotin och streptividin använts framgångsrikt för delvis rening av biologiskt viktiga RNA och protein komplex. Men denna strategi lider en stor nackdel som begränsar dess bredare utnyttjande: biotin/streptividin interaktionen kan brytas under denatureringen villkor som också stör integriteten för de eluerade komplex, därmed utgör hinder för deras efterföljande funktionell analys och/eller ytterligare rening av andra metoder. Dessutom är de eluerade proverna ofta förorenat med bakgrunden proteinerna som nonspecifically förknippar med streptividin pärlor, komplicerar analysen av renat komplexen av silverfärgning och masspektrometri. För att övervinna dessa begränsningar, vi utvecklat en variant av biotin/streptividin strategin som biotin är kopplad till en RNA-substrat via en foto-cleavable länkare och komplexen orörlig på streptividin pärlor elueras selektivt till lösning i en Native form av långvåg UV, lämnar proteinerna som bakgrund på pärlor. Kortare RNA bindande substrat kan syntetiseras kemiskt med biotin och foto-cleavable länkaren kovalent bifogas 5′ slutet av RNA, medan längre RNA substrat kan förses med två grupper av en kompletterande oligonukleotiden. Dessa två varianter av UV-eluering metoden testades för rening av U7 snRNP-beroende bearbetning komplex som klyver Histon pre-mRNA i slutet 3′ och de båda visat att jämföra gynnsamt till andra tidigare utvecklat reningsmetoder. UV-elueras proverna innehöll lätt påvisbara mängder av U7 snRNP som var fritt från föroreningar i stora protein och lämplig för direkt analys av masspektrometri och funktionella analyser. Den beskrivna metoden kan lätt anpassas för rening av andra RNA-bindande komplex och används tillsammans med singel – och dubbelsträngat DNA bindande platser för att rena DNA-specifika proteiner och makromolekylärt komplex.
Introduction
I Eukaryoter genomgå RNA-polymeras II-genererade mRNA prekursorer (pre-mRNA) flera mognad händelser i kärnan innan det blir fullt fungerande mRNA mallar för proteinsyntesen i cytoplasman. En av dessa händelser är 3′ slutet bearbetning. För den stora majoriteten av pre-mRNA innefattar 3′ avsluta behandlingen klyvning kopplad till polyadenylation. Denna två-stegs reaktion katalyseras av en relativt riklig komplex bestående av mer än 15 proteiner1. Djur replikering-beroende Histon pre-mRNA behandlas i 3′ slutet av en annan mekanism där rollen spelas av U7 snRNP, en låg överflöd komplex bestående av U7 snRNA ~ 60 nukleotider och flera proteiner2,3 . U7 snRNA basparen med en specifik sekvens i Histon pre-mRNA och en av subunitsna av den U7 snRNP katalyserar reaktionen klyvning, genererar mogen Histon mRNA utan en poly(A) svans. 3′ slutet bearbetning av Histon pre-mRNA kräver också Stem-Loop bindande Protein (SLBP), som binder en bevarade stem-loop som ligger uppströms webbplatsen klyvning och förbättrar rekrytering av den U7 snRNP till substrat2,3. Studier som syftar till att identifiera enskilda komponenter i den U7 snRNP har varit utmanande på grund av den låga koncentrationen av den U7 snRNP i djurceller och tendensen av anläggningen att dissociera eller genomgå partiell proteolys under reningen till följd av att milda tvättmedel4,5,6, hög salt tvättar eller flera kromatografiska steg7,8,9.
Nyligen, för att bestämma sammansättningen av U7-beroende bearbetningsmaskiner, en korta fragment av Histon pre-mRNA som innehåller biotin på antingen 3 eller 5′ var inkuberas med en nukleär extrakt och monterade komplexen fångades på streptividin-belagd agaros pärlor5,6,10. På grund av exceptionellt stark växelverkan mellan biotin och streptividin, var proteiner orörlig på streptividin pärlor elueras under denatureringen villkor genom kokning i SDS och analyseras av silverfärgning och masspektrometri. Medan denna enkla metod identifierat ett antal komponenter i den U7 snRNP, gav det ganska grov prover, ofta förorenade med ett stort antal bakgrund proteiner nonspecifically bunden till streptividin pärlor, potentiellt maskera vissa komponenter i maskinen och förhindra deras upptäckt på silver färgade geler5,6,10. Allt utesluten detta tillvägagångssätt också någon funktionella studier med isolerade materialet och dess ytterligare rening till homogenitet med ytterligare metoder.
Ett antal ändringar föreslogs över tid att ta itu med den nästan oåterkalleliga karaktär av biotin/streptividin samverkan, med de flesta av dem utformas antingen försvaga interaktionen eller tillhandahålla en kemiskt cleavable spacer arm i den som innehåller biotin reagenser11,12. Nackdelen med alla dessa ändringar var att de avsevärt minska effektiviteten av metod eller ofta krävs icke-fysiologiska förhållanden under eluering steg, äventyra integriteten eller aktivitet av de renade proteinerna.
Här beskriver vi en annan strategi för att lösa det inneboende problemet i strategin biotin/streptividin med hjälp av RNA substrat som biotin är kovalent bifogas den 5′ slut via en foto-cleavable 1-(2-nitrofenyl) etyl-delen som är känsliga för långt vinka UV13,14. Vi testade detta tillvägagångssätt för rening av den begränsande U7-beroende bearbetning maskinen från Drosophila och däggdjurs nukleära extrakt15. Efter en kort inkubation av Histon pre-mRNA som innehåller biotin och foto-cleavable länkaren med en nukleär extrakt, de monterade bearbetning komplex orörlig på streptividin pärlor, noggrant tvättas och försiktigt ut till lösning i en infödd form av exponering för ~ 360 nm UV ljus. UV-eluering metoden är mycket effektiv, snabb och okomplicerad, ger tillräckliga mängder av de U7 snRNP att visualisera dess komponenter av sliver färgning från så lite som 100 µL av extraktet15. UV-elueras materialet är fri från bakgrunden proteiner och lämplig för direkt masspektrometri analys, ytterligare reningssteg och enzymatisk analyser. Samma metod kan antas för rening av andra RNA och protein komplex som kräver relativt korta RNA bindningsställen. Biotin och foto-cleavable länkaren kan även kovalent kopplas till singel – och dubbelsträngat DNA, potentiellt utvidga UV-eluering metoden för rening av olika DNA och protein komplex.
Kemisk syntes av RNA substrat som innehåller kovalent fäst biotin och foto-cleavable länkaren är praktiskt endast med de sekvenser som inte överstiger ~ 65 nukleotider, blir dyrt och ineffektivt för betydligt längre sekvenser. För att lösa detta problem, har vi också utvecklat en alternativ metod som är lämplig för mycket längre RNA bindande mål. I denna strategi, RNA av valfri längd och nukleotid sekvens är genererade i vitro genom T7 eller SP6 transkription och glödgas till en kort kompletterande oligonukleotiden som innehåller biotin och foto-cleavable länkaren i slutet 5′ (trans konfiguration). Den resulterande duplex används därefter att rena individuella bindande proteiner eller makromolekylära komplex på streptividin pärlor efter samma protokoll som beskrivs för de RNA substrat som innehåller foto-cleavable biotin fäst kovalent (cis konfiguration). Med denna ändring, kan den foto-cleavable biotin användas tillsammans med in vitro- genererade avskrifter som innehåller hundratals nukleotider, utvidga den UV-eluering metoden för rening av ett brett utbud av RNA och protein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den metod som beskrivs här är okomplicerat och förutom införliva en foto-cleavable länkare och UV-eluering steget skiljer sig inte från de vanliga metoder att utnyttjar den extremt starka växelverkan mellan biotin och streptividin. Det UV-eluering steget är mycket effektiv, vanligtvis släppa mer än 75% av immobiliserade RNA och associerade proteiner från streptividin pärlor, lämnar bakom en hög bakgrund av proteiner som icke-specifikt binder till pärlorna. Genom att eliminera denna bakgrund, ger steget UV-…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar våra kolleger och medarbetare för deras bidrag till vårt arbete. Denna studie stöddes av NIH bevilja GM 29832.
Materials
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
Referências
- Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3′-end processing. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
- Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d’Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
- Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3′ end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
- Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 ‘-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
- Sabath, I., et al. 3 ‘-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
- Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
- Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2′- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
- Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
- Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
- Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 ‘-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
- Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5′-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
- Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
- Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ‘ exonuclease that specifically interacts with the 3 ‘ end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
- Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3’hExo, a 3′ exonuclease specifically interacting with the 3′ end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
- Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3’hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
- Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
- Dominski, Z., et al. 3′ end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
- Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ‘ end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
- Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
- Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3′ processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
- Thomas, M. F., L’Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
- Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3′ end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).
