Estabelecimento de linhas de celulares superexpressão DR3 para avaliar a resposta Apoptotic a terapêutica antimitótica

Resumo

Estabelecer uma linha de celular estável superexpressão de um gene de interesse para estudar a função do gene pode ser feito por estável do transfection-colheita única clones, depois transfecting-los através de infecção retroviral. Aqui nós mostramos que linhas de célula HT29-DR3 geradas desta forma elucidar os mecanismos pelos qual morte receptor 3 (DR3) contribui para a apoptose induzida por antimitotics.

Resumo

Estudar a função de um gene de interesse pode ser conseguido manipulando o seu nível de expressão, tais como diminuindo sua expressão com linhagens celulares "knockdown" ou aumentando a sua expressão com linhas de células de superexpressão. Transfecção transiente e estável são dois métodos que são usados frequentemente para a expressão dos genes exógenos. Transfecção transiente é útil somente para expressão de curto prazo, Considerando que transfection estável permite que genes exógenos ser integrado no genoma da célula de acolhimento onde ele será continuamente expressa. Como resultado, transfection estável é geralmente empregado para pesquisa em regulamento genético a longo prazo. Aqui descrevemos um protocolo simples para gerar uma linha de celular estável superexpressão do receptor de morte marcou 3 (DR3) para explorar a função DR3. Nós escolhemos o único clones após uma infecção retroviral a fim de manter a homogeneidade e a pureza das linhas celulares estável. As linhas de célula estável geradas usando este protocolo processam DR3-deficiente HT29 células sensíveis às drogas antimitóticas, assim, reconstituir a resposta de apoptose em células HT29. Além disso, o tag da bandeira no DR3 compensa a indisponibilidade de bom anticorpo DR3 e facilita o estudo bioquímico do mecanismo molecular pelo qual agentes antimitóticos induzem apoptose.

Introdução

Expressão gênica heteróloga é frequentemente usado para estudar a função dos genes de interesse. Dois métodos, transfecção transiente e estável, são predominantemente utilizados em células e biologia molecular para inserir um segmento de DNA ou RNA em uma célula de acolhimento^1,2. Transitoriamente transfectadas DNA ou RNA não pode ser passado às células, para que a alteração genética só pode ser retida por um curto período de tempo. Por outro lado, nas células transfectadas estàvel, genes exógenos são integrados no genoma da célula de acolhimento, sustentando a sua expressão na linhagem celular. Assim, transfe....

Protocolo

Por favor, note que todos os experimentos de rato aqui descritos foram aprovados e efectuados de acordo com o cuidado de Animal institucional e uso Comité (IACUC) na Universidade de Tsinghua.

1. geração de linhas de células de superexpressão DR3

1. Construir o plasmídeo de expressão DR3 (pMXs-IRES-DR3-bandeira), inserindo cDNA de DR3 completo com 3 x bandeira no C-terminal em vetor retroviral pMXs-IRES-Blasticidin dos locais de restrição de BamHI/XhoI.
2. Desenvolvem-se células Plat-A em pratos de 60 mm com 4 mL de meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM). No dia seguinte, quando as células atingem 80% - 90% confluência, t....

Resultados

Uma caracterização das pilhas HT29 estàvel expressando DR3 é mostrada na Figura 1. Os clones expressam níveis variados de DR3, enquanto as células do tipo selvagem, que serve como um controle negativo, não mostram a expressão dos genes exógenos. Aqui mostramos apenas cinco clones, entre os quais clonar 1 e 5 expressam o alto nível de DR3. Nós escolhemos o clone 1 e 5 para os experimentos seguintes.

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Discussão

Este manuscrito, descrevemos um método para gerar linhas de célula estável HT29-DR3. HT29-DR3 células fornecem um modelo para estudar os mecanismos moleculares pelos quais DR3 contribui para a apoptose induzida por agentes antimitóticos. Esta abordagem é versátil e repetíveis. Para garantir o sucesso do procedimento, quatro etapas-chave do protocolo precisam ser considerados. Em primeiro lugar, a fim de produzir uma alta suficiente concentração de vírus, recomenda-se realizar a transfeccao de DNA quando as células Plat-A.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	Invitrogen	C11965500BT	Suplementado com 10% de FBS e 1% de Penicilina/Estreptomicina
Ensaio de Viabilidade de Células Luminescentes	Promega	G7571
Paclitaxel	Selleck	S1150
pMXs-IRES-Blasicidin	Cell Biolabs	RTV-016
Dimetilsulfóxido Sigma		D2650
PBS	Invitrogen	C14190500BT
Tripsina-EDTA (0,25%)	Invitrogen	25200056
1,5-Dimetil-1,5-diazaundecametileno polimetobromida	Santa Cruz	sc-134220
Reagente de transfecção	Promega	E2311
Anticorpo secundário anti-camundongo	Jackson ImmumoResearch	115-035-166
anticorpo anti-bandeira	Linha celular Sigma	F-3165
HT29 Linha celular	ATCC	HTB-38
plat-A Linha celular	Cell Biolabs	RV-102
PVDF Immobilon-P	Millipore	IPVH00010
Cilindro de clonagem	Sigma	C1059
Leitor multimodo de imagem celular	Biotek	BTCYT3MV
CKX53 Microscópio invertido		poços Placas
de cultura de células de 12 poços	Placas	de cultura de células Nest 712001
60 mm	Tubos	de
0,22 μ m filtro estéril	SLGP033RB		Millipore
5810 R	Eppendorf	5810000327
Microplaca de Poliestireno Branco de 96 Poços	Corning	3903
Western ECL Substrate	BIO-RAD	1705060
ImageQuant LAS 4000	GE Healthcare	ImageQuant LAS 4000
Descolorindo Shaker	HINOTECH	TS-2000A
Blasticidina	InvivoGen	ant-bl-1
Contador de células automatizado	BIO-RAD	TC 20
Opti-MEM I Soro Reduzido Meio	Thermo	Fisher 31985070

Placas de cultura de células de 12 centrífuga de 15 mL Nest 705001 601052 Centrífuga