Protokollen illustrerer brugen af histopatologisk undersøgelse og Immunhistokemi til folat receptor beta makrofag og dens forhold til den samlede immun celle infiltrere i tidsmæssige arterie biopsier i kæmpe celle arteritis-profil.
Kæmpe celle arteritis (GCA) er en kronisk immun-medieret sygdom af mellemstore til store mellemstore arterier, der påvirker ældre voksne. GCA manifester med gigt og okklusiv symptomer af hovedpine, slagtilfælde eller vision tab. Makrofager og T-hjælper lymfocytter infiltrere vaskulære væggen og producere en pro-inflammatoriske respons, der fører til fartøj skade og iskæmi. Til dato, er der ingen GCA biomarkør, der kan overvåge sygdom aktivitet og guide terapeutisk respons.
Folat receptor beta (FRB) er et glycosylphosphatidylinositol protein, der er forankret på cellemembraner og normalt udtrykt i myelomonocytic afstamning og i fleste myeloid leukæmiceller så godt som i tumor og reumatoid synovial makrofager, hvor dens udtryk korrelerer med sygdommens sværhedsgrad. FRB evne til at binde folat forbindelser, folinsyre-konjugater og antifolate narkotika har gjort det et druggable mål i kræft og inflammatorisk sygdom forskning. Denne rapport beskriver de histopatologiske og immunhistokemiske metoder anvendt til at vurdere udtryk og distribution af FRB i forhold til GCAimmunopathology.
Formalin-fast og paraffin-embedded tidsmæssige arterie biopsier fra GCA og normal kontrol var plettet med hæmatoxylin og Eosin gennemgå væv histologi og identificere patognomoniske funktioner. Immunhistokemi blev brugt til at registrere FRB, CD68 og CD3 udtryk. En mikroskopisk analyse blev udført for at kvantificere antallet af positivt farvede celler på 10 udvalgte høj-power-felt sektioner og deres respektive placeringer i arterievæggen.
Lymphohistiocytic (LH) inflammation ledsaget af intima hyperplasi og forstyrret elastisk lamina blev set i GCA med ingen fundet i kontrolelementer. LH infiltrere var sammensat af ca 60% lymfocytter og 40% makrofager. FRB udtryk var begrænset til makrofager, bestående af 31% af den samlede CD68 + makrofag befolkning og lokaliseret til de medier og adventitia. Ingen FRB blev set i kontrolelementer.
Denne protokol viste en tydelig numeriske og rumlige mønster af FRB makrofag i forhold til de vaskulære immun mikromiljø i GCA.
Kæmpe celle arteritis (GCA) er en inflammatorisk sygdom i mellemstore til store arterier, målretning aorta og dens grene og påvirker ældre voksne. Det præsenterer med mild til svær iskæmiske komplikationer såsom hovedpine, kæbesmerter, synstab, slagtilfælde og væv koldbrand. Diagnosen er bekræftet af høje inflammatoriske markører som blodsænkning (ESR) og en særskilt histopatologisk mønster på den tidsmæssige arterie biopsi (FANE)1. GCA er den mest almindelige voksne vaskulitis, og tilgængeligheden af den tidsmæssige arterie opnået for diagnose præsenterer en fordel over andre vasculopathies, således at en til at studere dens patogenese lettere. De typiske fund på fanen omfatte en infiltrere makrofager/histiocytes og T-lymfocytter, der findes på tværs af alle vaskulære lag af tunica intima, media og adventitia med samtidige ødelæggelse af det elastiske lamina, der normalt adskiller disse rum2. Den nuværende dokumentation viser, GCA indebærer en ukendt antigen, der aktiverer dendritiske celler i det vaskulære adventitia, efterfulgt af ansættelse af hjælper T (Th) celler, specielt Th1 og Th17 undertyper, som udskiller interleukin-17 og interferon-gamma (IFG) henholdsvis. IFG så rekrutter og aktiverer makrofager at producere cytokiner og proteaser. Disse omfatter pro-inflammatoriske cytokiner; herunder IL-12, som gensidigt aktiverer Th1 celler giver dermed en positiv feedback loop; tumor nekrose faktor og interleukin-6, som forårsager gigt og feber og metalloproteases, der skader den elastiske lamina. Glukokortikoider (GC), som udgør den standard kronisk terapi, styre delvist cytokin veje af formildende Th17/IL-17 men ikke Th1/IFG armen af immunrespons3,4. Desværre, seponering af GC resulterer i sygdom tilbagefald. Som en alternativ modalitet, methotrexat har været repurposed GCA behandling, men de ønskede kliniske endepunkter var ikke konsekvent opnået selv om mere følsomme biomarkører ikke har blevet udnyttet for terapeutisk overvågning5,6 . I 2017, blev interleukin 6 blocker, tocilizumab, godkendt til behandling af GCA som det effektivt demonstreret sygdomsbekæmpelse og steroid besparende effekter7,8.
Til dato, er der ingen gode biomarkører for GCA. Som følge heraf er det vanskeligt at overvåge sygdomsaktivitet og titreres doser af tilgængelige lægemidler til at undgå negative virkninger og mindske byrden af omkostninger for samfundet. Det er således bydende nødvendigt at lede efter en kandidat biomarkør, korrelerer med sygdomsaktivitet, giver nye indsigter om patogenese og støtte i terapeutiske beslutninger.
Dysregulering af makrofag aktivering er en kritisk faktor i GCA patogenese. Et effektivt middel til behandling af GCA kan således selektiv målretning af aktiverede makrofager. Folat receptor beta (FRB) er en glycosyl-phosphatidylinositol glykoprotein, der er forankret på cellemembranen udtrykt i normal myelomonocytic celler, myeloid leukæmiceller og aktiverede makrofager. Dets ligand, folinsyre, er et vigtigt vitamin i sin reduceret form, som giver cellulære DNA syntese, methylering og reparation9. FRB udtryk er induceret i autoimmun sygdom og under carcinogenese. Dens udtryk er begrænset til overfladen af monocytter eller pro-inflammatoriske M1 makrofager i reumatoid artritis, eller til anti-inflammatoriske M2 makrofager i solid orgel og myeloide maligniteter10,11,12 , 13. ud over dens potentielle rolle som en biomarkør for aktiverede makrofager, FRB kan aktivere selektive stof transport gennem en multi-trins proces, der starter med receptor binding til folinsyre, antifolates eller folat-konjugeret narkotika på cellen overflade, efterfulgt af internalisering, udgivelse og eventuel levering af ønskede stof til de indre celle maskiner12,14,15,16. I modsætning til FRB udtrykt i kræftceller og aktiverede makrofager, FRB udtrykt i normal hæmatopoietisk celler er i stand til at binde folater, hvorved det sikres, at FRB/folat-medieret medicinafgivelse er begrænset til FRB-positive inflammatoriske eller kræftceller.
I vores tidligere undersøgelse, vi viste for første gang, at FRB udtrykkes i GCA makrofager og sit udtryk korreleret med CD68 + og endothelin receptor beta makrofager, som bidrager til GCA patogenese17. I denne betænkning, vi beskrive den histopatologiske og immunhistokemiske metoder anvendt til at vurdere FRB makrofag, og analyseret den samlede lymfocytter og makrofager tæller for at få indsigt i FRB’S position i GCA vaskulære landskab.
GCA er den mest almindelige vaskulitis hos voksne, og dens patologiske hallmark eksemplificerer en potent kombination af T helper lymfocytter og aktiveret makrofager, der kan også findes i andre granulomatøs sygdomme eller vasculopathies som sarcoidose og granulomatøs polyangiitis2,3. I GCA, den tidsmæssige arterie giver en god repræsentation af en medium til large størrelse arterie og TA biopsi giver en betragtelig stikprøve, der kan gemmes i paraffinblok…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev muliggjort med støtte fra Dr. Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, Division for reumatologi/Institut for medicin og molekylær og histopatologisk Core laboratorium, Penn State University College of Medicine, Hershey PA.
Microtome | Reichert-Jung | ||
plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
Vertical rack | Fisher Scientific | ||
Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
Xylene | |||
Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
3% hydrogen peroxide in TBS | |||
Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
Placental tissue | for FRB positive control |