Roman processen for 3D udskrivning Decellularized matricer
Summary
Denne protokol beskriver produktionen af polycaprolactone (PCL) glødetrådens med integrerede polylactic syre (PLA) mikrokugler, som indeholder decellularized matricer (DM) for 3D udskrivning af strukturelle tissue engineering konstruktioner.
Abstract
3D bioprinting sigter mod at oprette brugerdefinerede stilladser, der er biologisk aktive og rumme den ønskede størrelse og geometri. Et termoplastisk rygraden kan give mekanisk stabilitet svarende til native væv, mens biologiske agenser tilbyde kompositoriske stikord til stamceller, fører til deres migration, spredning og differentiering til at rekonstruere de oprindelige væv / organer1,2. Desværre, mange 3D udskrivning kompatibel, bioresorbable polymerer (f.eks polylactic syre, PLA) er trykt på temperaturer på 210 ° C eller højere – temperaturer der er til skade for biologiske lægemidler. På den anden side er polycaprolactone (PCL), en anden type af polyester, en bioresorbable, 3D printable materiale, der har en blidere udskrivning temperatur på 65 ° C. Derfor, det var en hypotese at decellularized ekstracellulære matrix (DM) indeholdt i en termisk beskyttende PLA barriere kunne udskrives inden for PCL glødetråd og forblive i sin funktionelle kropsbygning. I dette arbejde blev osteochondral reparation programmet som hypotesen blev testet. Således var svin brusk decellularized og indkapslet i polylactic syre (PLA) mikrokugler, som blev derefter ekstruderet med polycaprolactone (PCL) i glødetrådens at producere 3D konstruktioner via smeltet deposition modellering. Konstruktioner med eller uden mikrokugler (PLA-DM/PCL og PCL(-), henholdsvis) blev evalueret for forskelle i overflade funktioner.
Introduction
Nuværende tissue engineering teknikker til kliniske applikationer såsom knogle, brusk, sener og ligament rekonstruktion bruge auto- og allografts til at reparere beskadiget væv. Hver af disse teknikker er udføres rutinemæssigt som en “guld standard” i klinisk praksis af første høst donorvæv enten fra patienten eller et dødt match, og derefter placere donorvæv i defekt site2. Disse strategier er dog begrænset af donor site sygelighed, donor site knaphed for store defekter, risiko for infektion og svært ved at finde grafts, der stemmer overens med den ønskede geometri. Desuden, har undersøgelser vist, at allografts anvendes til genopbygning har reduceret mekaniske og biologiske egenskaber sammenlignet med indfødte væv3. Med disse overvejelser i tankerne, har væv ingeniører for nylig omdannet til tre-dimensionelle (3D) bioprinting til at producere brugerdefinerede, komplekse geometrier, der er biologisk aktive og konstrueret til at rumme defekt størrelse og form samtidig tilstrækkelig mekaniske egenskaber indtil biologiske remodellering er fuldført.
Ideelt set ville en 3D-trykt stillads bestå af en polymer rygrad, der kan bevare den nødvendige mekaniske stabilitet af indfødte væv, mens de indarbejdet biologics tilbyde biokemiske stikord til omkringliggende celler, fører til deres migration, spredning, differentiering, og væv produktion2,5. Desværre, de fleste konstruktioner, der indeholder biologiske komponenter er lavet med geler eller polymerer, der er for svag til at modstå i vivo kræfter opleves af de målrettede væv for auto/allograft genopbygning. Andre polymerer såsom polylactic syre (PLA) er bioresorbable, 3D printable og lyd strukturelt, men udskrives ved temperaturer på eller over 210 ° C – gør det umuligt for biologics at være co trykte under fabrikation. Polycaprolactone (PCL) er en anden godkendt af FDA, bioresorbable polymer, der kan være 3D udskrives ved en lavere temperatur (65 ° C), som er blevet stadig mere populære i opdigte patient-specifikke implantater med komplekse morfologier5,6 ,7,8,9. Men de fleste bioprinters bruger pneumatisk teknologi gør det umuligt at udskrive PCL ved lavere temperaturer, hvor biologiske aktiviteter kan forblive uskadt. Til dato, har integration af disse polymerer med auto/allografts i en roman printable biomateriale endnu at blive realiseret. I mangel af sådant materiale er en sand tissue Engineering tilgang til væv genopbygning usandsynligt. Derfor har vi forsøgt at kombinere PLA, PCL, og decellularized allograft matricer (DM) til at udnytte fordelene ved hvert materiale for at fremstille en levedygtig konstruktion i stand til at rekonstruere kompliceret væv. Denne proces ville give den oprindelige mekaniske styrke nødvendigt at modstå i vivo styrker og den termiske stabilitet til at rumme tilsætningsstof fremstillingsindustrien i en konstruktion, der inducerer dannelsen af det ønskede væv.
I en nylig forsøg på at løse de førnævnte forhindringer, viste vi, at det er muligt at indkapsle decellularized brusk ekstracellulære matrix i en termisk beskyttende PLA barriere, der kan blive ekstruderet inden for PCL filamenter, opretholde evne til DM til at påvirke omkringliggende vært celler2. Dette har inspireret os til at søge klinisk effektive tilgange til væv genopbygning. I den aktuelle undersøgelse udnytte vi platform teknologien til at opbygge All-in-one stilladser, der omfatter PLA, DM og PCL (PLA-DM/PCL).
Vores mål er at forbedre effektivitet og nytte af allografts ved hjælp af den foreslåede roman biofabrication teknik til mere præcist sammenfatte indfødte væv, for at i sidste ende kan bruge dem i forskellige applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Begge decellularized matricer og 3D trykte PCL stilladser har selvstændigt vist sig at give mulighed for vedhæftning og spredning af celler, validering af deres brug til osteochondral reparation10,11,12. Brugen af decellularized matrix i engineering tilgange til væv reparation har været genstand for stor interesse og succes i de seneste2,3,<sup class="xref…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev delvist finansieret af et tilskud fra Pediatric ortopædiske samfund i Nordamerika (POSNA) og National Institutes of Health giver NIBIB R21EB025378-01 (sonderende bioteknologi forskning tilskud).
Materials
| Sieve machine | Haver & Boecker Tyler | Ro-Tap RX 29-E Pure | |
| Sieve 90 um | Fisherbrand | 170328156 | No. 170 |
| Sieve 53 um | Fisherbrand | 162513588 | No. 270 |
| Sieve 106 um | Fisherbrand | 162018121 | No. 140 |
| Sputter coater | Leica | n/a | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi, USA | n/a | |
| Filabot EX2 | Filabot.com | FB00061 | |
| Filabot Spooler | Filabot.com | FB00073 | |
| CAPA 6506 | Perstorp | 24980-41-4 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010023 | |
| 6" Fan | Comfort Zone, Amazon | n/a | |
| Ultrasonic Water Bath | Cole Parmer | SK-08895-13 | |
| Dreamer | FlashForge | n/a | |
| Drum Mixer | Custom made | n/a | Similar piece of equipment: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no&gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE |
| Micro Balance | Mettler Toledo, Fisher Scientific | 01-913-851 | |
| Simplify3D | Simplify3D | n/a | |
| SolidWorks | SolidWorks | n/a | |
| Microspheres | Produced in-house, see concurrently submitted JoVE submission | ||
| p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate | Millipore | 4876-5GM | |
| Phosphatase, alkaline | Roche Diagnostics GmbH | 10 713 023 001 | |
| Absorbance Reader | Tecan | Sunrise | |
| Tris-HCl Buffer | Sigma-Aldrich | T6455-100ML | |
| Heated shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 |
Referências
- Hutchmaker, D., Teoh, S., Zein, I., Ng, K. W., Schantz, J. -. T., Leahy, J. C. Design and Fabrication of a 3D Scaffold for Tissue Engineering Bone. Synthetic Bioabsorbable Polymers and Implants. 15 (2), 845-847 (1988).
- Ghosh, P., Gruber, S. M. S., Lin, C. -. Y., Whitlock, P. Microspheres containing decellularized cartilage induce chondrogenesis and remain functional after incorporation within a poly(caprolactone) filament useful for fabricating a 3D scaffold. Biofabrication. , (2018).
- Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
- Hutmacher, D. W. Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage. Biomaterials. 21 (24), 2529-2543 (2000).
- Kang, H., Hollister, S. J., La Marca, F., Park, P., Lin, C. -. Y. Porous biodegradable lumbar interbody fusion cage design and fabrication using integrated global-local topology optimization with laser sintering. Journal of biomechanical engineering. 135 (10), 101013-101018 (2013).
- Kang, H., Lin, C. Y., Hollister, S. J. Topology optimization of three dimensional tissue engineering scaffold architectures for prescribed bulk modulus and diffusivity. Structural and Multidisciplinary Optimization. 42 (4), 633-644 (2010).
- Lin, C. -. Y., et al. Functional bone engineering using ex vivo. gene therapy and topology-optimized, biodegradable polymer composite scaffolds. Tissue Engineering. 11 (9-10), 1589-1598 (2005).
- Lin, C. -. Y., Hsiao, C. -. C., Chen, P. -. Q., Hollister, S. J. Interbody Fusion Cage Design Using Integrated Global Layout and Local Microstructure Topology Optimization. Spine. 29 (16), 1747-1754 (2004).
- Zopf, D., Hollister, S., Nelson, M., Ohye, R., Green, G. Bioresorbable Airway Splint Created with a Three-Dimensional Printer. New England Journal of Medicine. 368 (21), 2043-2045 (2013).
- Pati, F., Song, T. H., Rijal, G., Jang, J., Kim, S. W., Cho, D. W. Ornamenting 3D printed scaffolds with cell-laid extracellular matrix for bone tissue regeneration. Biomaterials. 37, 230-241 (2015).
- Zhang, W., et al. The effect of interface microstructure on interfacial shear strength for osteochondral scaffolds based on biomimetic design and 3D printing. Materials Science and Engineering C. 46, 10-15 (2015).
- Williams, J. M., et al. tissue engineering using polycaprolactone scaffolds fabricated via. selective laser sintering. Biomaterials. 26 (23), 4817-4827 (2005).
- Monibi, F. A., Cook, J. L. Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioscaffolds: Emerging Applications in Cartilage and Meniscus Repair. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2017).
- Wiles, K., Fishman, J., Coppi, P., Birchall, M. The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions. Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (3), (2016).
- Sutherland, A. J., Detamore, M. S. Bioactive Microsphere-Based Scaffolds Containing Decellularized Cartilage. Macromolecular Bioscience. , (2015).
- Whitlock, P. W., Smith, T. L., Poehling, G. G., Shilt, J. S., Van Dyke, M. A naturally derived, cytocompatible, and architecturally optimized scaffold for tendon and ligament regeneration. Biomaterials. , (2007).
- Whitlock, P. W., et al. Effect of cyclic strain on tensile properties of a naturally derived, decellularized tendon scaffold seeded with allogeneic tenocytes and associated messenger RNA expression. Journal of surgical orthopaedic advances. 22 (3), 224-232 (2013).
- Whitlock, P. W., et al. A novel process for optimizing musculoskeletal allograft tissue to improve safety, ultrastructural properties, and cell infiltration. Journal of Bone and Joint Surgery – Series A. 94 (16), 1458-1467 (2012).
- Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Herman, I. M. Dynamic Reciprocity in the Wound Microenvironment. Wound Repair Regeneration. 19 (2), 134-148 (2012).
- Benders, K. E. M., van Weeren, P. R., Badylak, S. F., Saris, D. B. F., Dhert, W. J. A., Malda, J. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
- Crapo, P., Gilbert, T., Badylak, S. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Guan, Y., et al. Porcine kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration. Materials Science and Engineering C. 56, 451-456 (2015).
- Dean, R. L. Kinetic studies with alkaline phosphatase in the presence and absence of inhibitors and divalent cations. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (6), 401-407 (2002).
